Modificação genética de cianobactérias por conjugação usando o kit de ferramentas de clonagem modular CyanoGate

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo como i) montar um vetor auto-replicante usando o kit de ferramentas de clonagem modular CyanoGate, ii) introduzir o vetor em um hospedeiro cianobacteriano por conjugação, e iii) caracterizar cepas transgênicas de cianobactérias usando um leitor de placa ou citometria de fluxo.

Abstract

Cianobactérias são um grupo diversificado de organismos fotosintéticos procarióticos que podem ser geneticamente modificados para a produção renovável de commodities industriais úteis. Os avanços recentes na biologia sintética conduziram ao desenvolvimento de diversos toolkits da clonagem tais como CyanoGate, um sistema modular estandardizado da clonagem para construir vectors plasmid para a transformação subseqüente ou transferência conjugal em cianobacteria. Aqui descrevemos um método detalhado para a montagem de um vetor auto-replicante (por exemplo, carregando uma fita de expressão marcador fluorescente) e transferência conjugal do vetor para as cepas cianobacterianas Synechocystis sp. PCC 6803 ou Synechococcus Elongatus UTEX 2973. Além disso, descrevemos como caracterizar o desempenho de uma parte genética (por exemplo, um promotor) usando um leitor de placa ou citometria de fluxo.

Introduction

Cianobactérias são bactérias autotróficas que podem ser usadas para a biossíntese de uma grande variedade de produtos metabólicos naturais e heterologous de alto valor^{1,2,3,4,5, 6.} Vários obstáculos ainda precisam ser superados para expandir sua viabilidade comercial, mais notavelmente, os rendimentos relativamente pobres em comparação com as bioplataformas heterotróficas (por exemplo, Escherichia coli e levedura)⁷. A recente expansão das ferramentas de engenharia genética disponíveis e a adoção do paradigma da biologia sintética na pesquisa cianobacteriana estão ajudando a superar tais desafios e desenvolver ainda mais as cianobactérias como biofábricas eficientes^{8, 9,10.}

As principais abordagens para a introdução do DNA em cianobactérias são transformação, conjugação e eletroporação. Os vetores transferidos para cianobactérias por transformação ou eletroporação são vetores “suicidas” (ou seja, vetores integrativos que facilitam a recombinação homóloga), enquanto vetores auto-replicantes podem ser transferidos para cianobactérias por transformação, conjugação ou eletroporação. Para o primeiro, um protocolo está disponível para a engenharia de espécies modelo passível de transformação natural¹¹. Mais recentemente, um kit de ferramentas modular de clonagem (MoClo) para cianobactérias chamado CyanoGate foi desenvolvido que emprega um método padronizado de montagem de vetores Golden Gate para engenharia usando transformação natural, eletroporação ou conjugação¹².

Golden Gate-tipo técnicas de montagem tornaram-se cada vez mais popular nos últimos anos, e os padrões de montagem e bibliotecas parte estão agora disponíveis para uma variedade de organismos^{13,14,15,16 17}de^pessoas. Golden Gate usa enzimas de restrição iis tipo (por exemplo, BsaI, BpiI, BsmBI, BtgZI e AarI) e um terno de aceitadores e saliências únicas para facilitar a montagem hierárquica direcional de várias seqüências em uma reação de montagem de “um pote”. Enzimas de restrição tipo IIS reconhecem uma seqüência assimétrica única e reduzem uma distância definida de seus locais de reconhecimento para gerar um corte escalonado de “extremidade pegajosa” (tipicamente uma saliência de 4 nucleotídeos [NT]), que pode ser posteriormente explorada para dirigir o DNA ordenado reações de montagem^15,18. Isso facilitou o desenvolvimento de grandes bibliotecas de peças modulares de nível 0 (por exemplo, promotores, quadros de leitura aberta e exterminadores) definidos por uma sintaxe comum, como o padrão PhytoBricks¹⁹. As peças de nível 0 podem então ser prontamente montadas em de expressão de nível 1, seguindo as quais conjuntos de ordem superior mais complexos (por exemplo, construções de expressão multigênica) podem ser construídos em um vetor de aceitação de escolha^12,15. Uma vantagem fundamental das técnicas de montagem do tipo Golden Gate é a sua comodidade à automação em instalações de alta produção, como fundições de DNA^20,21,que podem permitir o teste de projetos experimentais complexos que não pode ser facilmente alcançado por trabalho manual.

CyanoGate baseia-se no sistema moclo planta estabelecido^12,15. Para incorporar uma nova parte no CyanoGate, a sequência de parte deve primeiro ser domesticada, ou seja, sites de reconhecimento “ilegais” para BsaI e BpiI devem ser removidos. No caso de uma codificação de parte para um quadro de leitura aberta (ou seja, uma sequência de codificação, CDS), os sites de reconhecimento podem ser interrompidos gerando mutações sinônimos na sequência (ou seja, alterando um códon para uma alternativa que codifica para o mesmo resíduo de aminoácidos). Isso pode ser alcançado por uma variedade de abordagens, que vão desde a síntese de DNA até estratégias baseadas em amplificação de amplificação de polimerase (PCR), como a montagem^{Gibson 22.} Dependendo da expressão do hospedeiro que está sendo usada, o cuidado deve ser tomado para evitar a introdução de códons raros que poderiam inibir a eficiência da tradução^23. Remover sites de reconhecimento em sequências de promotores e exterminadores é tipicamente um esforço mais arriscado, pois as modificações podem afetar a função e a parte pode não funcionar como esperado. Por exemplo, as alterações aos locais de ligação ao fator de transcrição putativa ou ao site de ligação ribossoma dentro de um promotor podem alterar a força e a capacidade de resposta à indução/repressão. Da mesma forma, as modificações nas principais características estruturais do exterminador do futuro (por exemplo, o caule rico gc, loop e cauda poli-U) podem alterar a eficiência da terminação e afetar a expressão gênica^24,25. Embora vários recursos on-line estejam disponíveis para prever a atividade das sequências de promotores e exterminadores, e informem se uma mutação proposta afetará o desempenho^26,27,essas ferramentas são muitas vezes preditores pobres de desempenho em cianobactérias^28,29,30.. . Como tal, a caracterização in vivo de peças modificadas ainda é recomendada para confirmar a atividade. Para ajudar com a clonagem de seqüências recalcitrantes, CyanoGate inclui uma cópia baixa de clonagem vetor convidado com base no vetor BioBrick pSB4K5^12,16,31. Além disso, um portal “Design and Build” está disponível através da Fundição do Genoma de Edimburgo para ajudar com o design vetorial (dab.genomefoundry.org). Por último, e mais importante, CyanoGate inclui dois projetos de vetor de aceitação nível T (equivalente a vetores de aceitadores de nível 2)¹⁵ para a introdução de DNA em cianobactérias usando vetores de suicídio, ou vetores de alcance de hospedeiro amplo capaz de auto-replicação em várias espécies cianobacterianas^32,33,34.

Aqui vamos nos concentrar em descrever um protocolo para a geração de níveis T auto-replicantes vetores e a modificação genética de Synechocystis PCC 6803 e Synechococcus elongatus utex 2973 (Synechocystis PCC 6803 e S. elongatus UTEX 2973 depois disso) por conjugação (também conhecido como acasalamento triparental). A transferência conjugal de DNA entre células bacterianas é um processo bem descrito e tem sido usado anteriormente para a engenharia de espécies cianobacterianas, em particular aquelas que não são naturalmente competentes, como s. alongatus UTEX 2973^{35, 36,37,38,39,40,41.} Em resumo, as culturas cianobacterianas são incubadas com uma cepa De. coli carregando o vetor a ser transferido (o vetor de “carga”) e vetores (seja na mesma cepa de E. coli ou em cepas adicionais) para permitir a conjugação (“mobilizador” e vetores de “ajudantes”). Quatro condições-chave são necessárias para a transferência conjugal ocorrer: 1) o contato direto entre as células envolvidas na transferência de DNA, 2) o vetor de carga deve ser compatível com o sistema de conjugação (ou seja, deve conter uma origem adequada de transferência (oriT), também conhecido como um bom (base de mobilidade) site), 3) uma proteína de corte de DNA (por exemplo, codificada pelo gene da máfia) que corta DNA no oriT para iniciar a transferência de dna para o cianobacterium deve estar presente e expressa de ambos os vetores de carga ou ajudante, e 4) o DNA transferido não deve ser destruído no receptor cyanobacterium (ou seja, deve ser resistente à degradação por, por exemplo, restrição atividade endosnuclease)^35,42. Para que o vetor de carga persista, a origem da replicação deve ser compatível com a ciaanobacterium receptora para permitir a auto-replicação e proliferação em células filhas pós divisão. Para ajudar com as condições 3 e 4, vários vetores auxiliares estão disponíveis através de Addgene e outras fontes comerciais que codificam para a máfia, bem como várias metilases para proteger de endonucleases nativas no host cyanobacterium⁴³. Neste protocolo, a conjugação foi facilitada por uma cepa MC1061 E. coli carregando mobilizadores e vetores auxiliares pRK24 (www.addgeneorg/51950) e pRL528 (www.addgene.org/58495), respectivamente. Deve ser tomado cuidado ao escolher os vetores para serem usados para transferência conjugal. Por exemplo, no kit CyanoGate o vetor de carga auto-replicante pPMQAK1-T codifica uma proteína Mob¹². No entanto, pSEVA421-T não^44,e, como tal, mob deve ser expressa a partir de um vetor ajudante adequado. Os vetores utilizados também devem ser apropriados para o organismo alvo. Por exemplo, a transferência conjugal eficiente em Anabaena sp. PCC 7120 requer um vetor auxiliar que proteja o vetor de mobilização contra a digestão (por exemplo, pRL623, que codifica as três metilases AvaiM, Eco47iiM e Ecot22iM)^{45, 46.}

Neste protocolo, descrevemos ainda mais como caracterizar o desempenho das peças (ou seja, promotores) com um marcador fluorescente usando um leitor de placa ou um citometro de fluxo. Os citometros de fluxo são capazes de medir a fluorescência em uma única base celular para uma grande população. Além disso, os citometros de fluxo permitem aos usuários “portar” os dados adquiridos e remover o ruído de fundo (por exemplo, de material particulado na cultura ou contaminação). Em contraste, os leitores de placas adquirem uma medida agregada de fluorescência de um determinado volume de cultura, normalmente em vários poços de replicar. As principais vantagens dos leitores de placas sobre os citometros incluem o menor custo, maior disponibilidade e, normalmente, nenhum requisito para software especializado para análises de dados a jusante. As principais desvantagens dos leitores de placas são a sensibilidade relativamente menor em comparação com citometros e problemas potenciais com a densidade óptica de culturas medidas. Para análises comparativas, as amostras do leitor de placas devem ser normalizadas para cada poço (por exemplo, para uma medição da densidade cultural, normalmente tomada como a absorção na densidade óptica em 750 nm [OD_750]),o que pode levar a imprecisões para amostras que são também denso e/ou não bem misturado (por exemplo, quando propenso à agregação ou flocculação).

Como uma visão geral, aqui demonstramos em detalhes os princípios de geração de peças de nível 0, seguido s uma montagem hierárquica usando o kit CyanoGate e clonagem em um vetor adequado para transferência conjugal. Em seguida, demonstramos o processo de transferência conjugal, a seleção de cepas transconjugantes axenic expressando um marcador fluorescente e a subsequente aquisição de dados de fluorescência usando um citometro de fluxo ou um leitor de placa.

Protocol

1. Montagem vetorial usando os kits de ferramentas Plant MoClo e CyanoGate NOTA: Antes de prosseguir com a montagem vetorial, recomenda-se fortemente que os usuários se familiarizem com as estruturas de nível vetorial dos sistemas Plant e CyanoGate MoClo12,15. Construção de peças de nível 0NOTA: As peças de nível 0 podem ser sintetizadas como vetores completos ou como sequências lineares para montagem com aceitad…

Representative Results

Para demonstrar o fluxo de trabalho de montagem golden gate, uma fita de expressão foi montada no vetor de aceitação de nível 1 (Forward) (pICH47732) contendo as seguintes partes de nível 0: o promotor do operon C-phycocianina P cpc560 (pC0.005), contendo as seguintes partes de nível 0: o promotor do operon C-phycocianina P cpc560 (pC0.005), contendo as seguintes partes de nível 0: o promotor do operon C-phycocianina P cpc560 (pC0.005), contendo as seguintes partes de nível 0: o p…

Discussion

Golden Gate montagem tem várias vantagens em comparação com outros métodos de montagem vetorial, particularmente em termos de escalabilidade^20,21. No entanto, a criação do sistema Golden Gate em um laboratório requer tempo para desenvolver uma familiaridade com as várias partes e bibliotecas vetorial aceitadoras e processos de montagem em geral. O planejamento cuidadoso é muitas vezes necessário para assembléias mais complexas ou ao realizar um grande …

Materials

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)	Thermo Fisher Scientific	R0404	Used in 2.1.3.
Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt	Sigma-Aldrich	A2383	Used in Table 2.
Agar (microbiology tested)	Sigma-Aldrich	A1296-500g	Used in 8.3.
Agarose	Bioline	BIO-41026	Used in 6.
Attune NxT Flow Cytometer	Thermo Fisher Scientific	–	Used in 4.3.1.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	Used in Table 2.
BpiI (BbsI)	Thermo Fisher Scientific	ER1011	Used in Table 2.
BsaI (Eco31I)	Thermo Fisher Scientific	ER0291	Used in Table 2.
Carbenicillin disodium	VWR International	A1491.0005	Used in 2.1.3.
Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates	Sigma-Aldrich	CLS3527	Used in 4.1.3.
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Thermo Fisher Scientific	BP231-100	Used in 3.6.2.
DNeasy Plant Mini Kit	Qiagen	69104	DNA extraction kit. Used in 5.
FLUOstar Omega Microplate reader	BMG Labtech	–	Used in 4.2.2.
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Thermo Fisher Scientific	K0503	Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2.
Glass beads (0.5 mm diameter)	BioSpec Products	11079105	Used in 5.2.
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	10021083	Used in 2.3.1, 3.6.2.
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Thermo Fisher Scientific	10356553	Used in 2.1.3.
Kanamycin sulphate (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	11815-024	Used in 2.1.3.
Membrane filters (0.45 μm)	MF-Millipore	HAWP02500	Used in 3.3.7
Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEAR	Greiner Bio-One	655096	Used in 4.2.1.
Monarch DNA Gel Extraction Kit	New England Biolabs	T1020S	Used in 1.1.2.2.
Monarch PCR DNA Cleanup Kit	New England Biolabs	T1030	DNA purification kit. Used in 1.1.2.3.
Multitron Pro incubator with LEDs	Infors HT	–	Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4.
MyTaq DNA Polymerase	Bioline	BIO-21108	Used in 7.1.
NanoDrop One	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	Used in 2.3.3.
One Shot TOP10 chemically competent E. coli	Thermo Fisher Scientific	C404010	Used in 2.1.1.
Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate)	VWR International	K813	Used in 4.3.2.
Q5High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0491S	Used in 1.1.2.1.
Quick-Load 1 kb DNA Ladder	New England Biolabs	N0468S	Used in Figure 4.
Screw-cap tubes (1.5 ml)	Starstedt	72.692.210	Used in 3.6.3
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate	VWR International	J61820.06	Used in 2.1.3.
Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	612U96	Used in 4.3.1.
T4 DNA ligase	Thermo Fisher Scientific	EL0011	Used in Table 2.
TissueLyser II	Qiagen	85300	Bead mill. Used in 5.2.