JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Генетическая модификация цианобактерий путем конъюгации с помощью цианогейтмодульного клонирования Toolkit

Published: October 31, 2019
doi:
10.3791/60451
, , , ,
1Institute of Molecular Plant Sciences, School of Biological Sciences,University of Edinburgh, 2Centre for Synthetic and Systems Biology,University of Edinburgh, 3Institute of Quantitative Biology, Biochemistry and Biotechnology, School of Biological Sciences,University of Edinburgh

Summary

Здесь мы представляем протокол, описывающий, как i) собрать самовоспроизводящий вектор с помощью модульного инструментария клонирования CyanoGate, ii) ввести вектор в цианобактериальный хост путем спряжения, и iii) характеризуют трансгенные штаммы цианобактерий с помощью плита читателя или потока цитометрии.

Abstract

Цианобактерии представляют собой разнообразную группу прокариотических фотосинтетических организмов, которые могут быть генетически модифицированы для возобновляемого производства полезных промышленных товаров. Последние достижения в области синтетической биологии привели к разработке нескольких наборов инструментов клонирования, таких как CyanoGate, стандартизированная модульная система клонирования для построения векторов плазмида для последующей трансформации или супружеской передачи в цианобактерии. Здесь мы намечаем детальный метод для сборки самовоспроизводящегося вектора (например, проведение флуоресцентной маркерной экспрессии) и супружеской передачи вектора в цианобактериальные штаммы Synechocystis sp. PCC 6803 или Synechococcus эллонгат UTEX 2973. Кроме того, мы описываем, как охарактеризовать производительность генетической части (например, промоутер) с помощью считывателя пластин или цитометрии потока.

Introduction

Цианобактерии являются аутотрофными бактериями, которые могут быть использованы для биосинтеза широкого спектра природных и гетерологических продуктов высокой стоимости метаболических1,2,3,4,5 6. Несколько препятствий еще предстоит преодолеть, чтобы расширить свою коммерческую жизнеспособность, прежде всего, относительно низкие урожаи по сравнению с гетеротрофной био-платформ (например, Escherichia coli и дрожжей)7. Недавнее расширение доступных инструментов генной инженерии и поглощение парадигмы синтетической биологии в цианобактериальных исследованиях помогает преодолеть такие проблемы и дальнейшее развитие цианобактерий как эффективных биофабрик8, 9,10.

Основными подходами к внедрению ДНК в цианобактерии являются трансформация, спряжение и электропорация. Переносчики, передаваемые к цианобактериям путем трансформации или электропорации, являются «самоубийственные» векторами (т.е. интегративными векторами, способствующих гомологичной рекомбинации), в то время как самовоспроизводящиеся векторы могут быть перенесены на цианобактерии трансформация, спряжение или электропорация. Для первого, протокол доступен для инженерных видов модели поддаются естественной трансформации11. Совсем недавно был разработан модульный набор инструментов для клонирования (MoClo) для цианобактерий под названием CyanoGate, который использует стандартизированный метод векторной сборки Золотых ворот для проектирования с использованием естественной трансформации, электропорации или спряжения12.

Технологии сборки типа «Золотые ворота» становятся все более популярными в последние годы, а стандарты сборки и библиотеки частей теперь доступны для различных организмов13,14,15,16 ,17. Золотые ворота использует ферменты ограничения IIS типа (например, BsaI, BpiI, BsmBI, Btg’i и AarI) и костюм приемников и уникальные свесы для облегчения направленной иерархической сборки нескольких последовательностей в реакции сборки «одного горшка». Ферменты ограничения типа IIS распознают уникальную асимметричную последовательность и вырезают определенное расстояние от их сайтов распознавания, чтобы создать пошатнувшееся, «липкий конец» разреза (обычно 4 нуклеотида (nt) свеса), которые могут быть впоследствии использованы для привода упорядоченной ДНК сборки реакции15,18. Это способствовало развитию больших библиотек модульных частей уровня 0 (например, промоутеров, открытых кадров для чтения и терминаторов), определяемых общим синтаксисом, таким как стандарт PhytoBricks19. Части уровня 0 могут быть легко собраны в кассеты выражения уровня 1, после чего более сложные сборки более высокого порядка (например, многогенные конструкции выражения) могут быть построены в векторе принятия выбора12,15. Ключевым преимуществом методов сборки типа Golden Gate является их удобство автоматизации на высокопроизводительных объектах, таких как ДНК-литейные заводы20,21, которые могут позволить для тестирования сложных экспериментальных конструкций, которые не может быть легко достигнуто с помощью ручного труда.

CyanoGate строится на установленной системе Завода MoClo12,15. Для включения новой части в CyanoGate, часть последовательности должны быть сначала одомашнены, т.е. “незаконные” признания сайтов для BsaI и BpiI должны быть удалены. В случае кодирования детали для открытого кадра чтения (т.е. последовательности кодирования, CDS) сайты распознавания могут быть нарушены путем генерации синонимных мутаций в последовательности (т.е. изменение кодона на альтернативу, которая кодирует тот же остатками аминокислоты). Это может быть достигнуто с помощью различных подходов, начиная от синтеза ДНК полимеразы цепной реакции (PCR) усиления на основе стратегий, таких как Гибсон сборки22. В зависимости от используемого принимающего выражения следует позаботиться о том, чтобы избежать введения редких кодонов, которые могут препятствовать эффективности перевода23. Удаление сайтов распознавания в последовательности промоутера и терминатора, как правило, более рискованное усилие, так как изменения могут повлиять на функцию и часть может не выполнять, как ожидалось. Например, изменения в местах связывания фактора транскрипции или ribosome связывающий сайт внутри промоутера могут изменить силу и отзывчивость к индукции/репрессии. Аналогичным образом, изменения в ключевых структурных характеристиках терминатора (например, богатый стебель GC, петля и поли-U хвост) могут изменить эффективность прекращения и эффект экспрессии гена24,25. Хотя несколько интернет-ресурсов доступны для прогнозирования активности промотора и последовательности терминаторов, и сообщить, повлияет ли предлагаемая мутация на производительность26,27, эти инструменты часто являются плохими предикторами производительность у цианобактерий28,29,30.. Таким образом, in vivo характеристика модифицированных частей по-прежнему рекомендуется для подтверждения активности. Для оказания помощи в клонировании непокорных последовательностей, CyanoGate включает в себя низкий вектор клонирования копий на основе векторного bioBrick pSB4K512,16,31. Кроме того, портал “Дизайн и сборка” доступен через Эдинбургский геном литейный завод, чтобы помочь с векторным дизайном (dab.genomefoundry.org). Наконец, и самое главное, CyanoGate включает в себя два векторных конструкций приемного уровня T (эквивалент вектору приемного уровня 2)15 для введения ДНК в цианобактерии с использованием векторов самоубийств, или широких векторов диапазона, способных к самовоспроизводствам в нескольких видов цианобактерий32,33,34.

Здесь мы сосредоточимся на описании протокола для генерации самовоспроизводящих векторов уровня T и генетической модификации Synechocystis PCC 6803 и Synechococcus elongatus UTEX 2973(Synechocystis PCC 6803 и S. elongatus UTEX 2973 в дальнейшем) путем спряжения (также известный как три-родительских спаривания). Супружеская передача ДНК между бактериальными клетками является хорошо описанным процессом и ранее использовалась для инженерных цианобактериальных видов, в частности тех, которые не являются естественными компетентными, такими как S. elongatus UTEX 297335, 36,37,38,39,40,41. Короче говоря, цианобактериальные культуры инкубируются штаммом кишечной палочки, несущим переносчик (“грузовой” вектор) и векторами (либо в том же штамме кишечной палочки, либо в дополнительных штаммах), чтобы обеспечить спряжение (“мобилизатор” и векторы «помощника»). Для супружеской передачи требуется четыре ключевых условия: 1) прямой контакт между клетками, участвующими в передаче ДНК, 2) вектор груза должен быть совместим с системой спряжения (т.е. он должен содержать подходящее происхождение передачи(oriT), также известный как бом (основа мобильности) сайт), 3) ДНК nicking белка (например, кодируется моб гена), что ники ДНК на oriT инициировать одноцепочечную передачу ДНК в цианобактерий должны присутствовать и выражается от грузового или помощника векторов, и 4) переданная ДНК не должна быть уничтожена в цианобактериях цианобактерия (т.е. должна быть устойчива к деградации, например, ограничивая эндонуклеазией деятельности)35,42. Для того чтобы грузовой вектор сохранялся, происхождение репликации должно быть совместимо с цианобактерией получателя, чтобы обеспечить самовоспроизводство и распространение в дочерних ячеек после деления. Для помощи с условиями 3 и 4, несколько векторов помощника доступны через Addgene и другие коммерческие источники, которые кодируют для толпы, а также несколько метилаз, чтобы защитить от родной эндонуклизии в принимающей цианобактерий43. В этом протоколе спряжению способствовали штамм MC1061 E. coli, несущий мобилизатор и помощник векторов pRK24 (www.addgeneorg/51950) и pRL528 (www.addgene.org/58495), соответственно. Необходимо проявлять осторожность при выборе векторов, которые будут использоваться для супружеской передачи. Например, в комплекте CyanoGate самовоспроизводящий грузовой вектор pPM-AK1-T кодирует белок Mob12. Тем не менее, pSEVA421-T не44, и как таковой, толпа должна быть выражена из подходящего вектора помощника. Используемые векторы также должны соответствовать организму-мишеням. Например, эффективный супружеский перевод в Anabaena sp. PCC 7120 требует вектора помощника, который защищает вектор мобилизации от пищеварения (например, pRL623, который кодирует для трех метилазов AvaiM, Eco47iiM и Ecot22iM)45, 46.

В этом протоколе мы далее наметить, как охарактеризовать производительность частей (т.е. промоутеров) с флуоресцентным маркером с помощью считывателя пластин или цитометра потока. Цитометры потока способны измерять флуоресценцию на основе одной клетки для большой популяции. Кроме того, цитометры потока позволяют пользователям “загонять” полученные данные и удалять фоновый шум (например, от твердых частиц в культуре или загрязнении). В отличие от этого, считывательы пластин приобретают совокупное измерение флуоресценции данного объема культуры, как правило, в нескольких репликационных скважинах. Основные преимущества считывателей пластин над цитометрами включают более низкую стоимость, более высокую доступность и, как правило, отсутствие требований к специализированного программного обеспечения для анализа данных ниже по течению. Основными недостатками считывателей пластин являются относительно более низкая чувствительность по сравнению с цитометрами и потенциальные проблемы с оптической плотностью измеренных культур. Для сравнительного анализа образцы считывания пластин должны быть нормализированы для каждой скважины (например, для измерения плотности культуры, обычно в качестве абсорбции при оптической плотности в 750 нм, что может привести к неточностям для образцов, которые являются слишком плотной и/или не очень смешанной (например, при подверженности агрегации или флоккуляции).

В качестве обзора, здесь мы демонстрируем в деталях принципы генерации частей уровня 0, а затем иерархической сборки с использованием комплекта CyanoGate и клонирования в вектор, пригодный для супружеской передачи. Затем мы демонстрируем процесс конъюгальной передачи, выбор топорных трансконъюгантных штаммов, выражающих флуоресцентный маркер, и последующее получение данных флуоресценции с помощью цитометра потока или считывателя пластин.

Protocol

1. Векторная сборка с использованием инструментариев Plant MoClo и CyanoGate ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем приступить к векторной сборке, настоятельно рекомендуется, чтобы пользователи ознакомились с структурами уровня переносчиков систем завода и CyanoGate MoCloсистем 12,<sup …

Representative Results

Для демонстрации рабочего процесса сборки Золотых Ворот в векторе приемки 1-го уровня (Forward) (pICH47732) была собрана экспресс-кассета, содержащая следующие части уровня 0: промоутер C-фикоцианина оперона Pcpc560 (pC0.005), последовательность кодирования для eYFP (pC0.008) и дво…

Discussion

Сборка Золотых ворот имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами векторной сборки, особенно с точки зрения масштабируемости20,21. Тем не менее, настройка системы «Золотые ворота» в лаборатории требует времени для того, чтобы ознакомиться с разли…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы признательны Сети БИОтехнологии и биологических наук PHYCONET (BBSRC) в области промышленной биотехнологии и биоэнергетики (NIBB) и Центру инноваций в области промышленной биотехнологии (IBioIC) за финансовую поддержку. GARG, AASO и AP признают финансовую поддержку программы BBSRC EASTBIO CASE PhD (грант bb/M010996/1), Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACYT) PhD программы, а также программы совместного обучения IBioIC-BBSRC (CTP) Соответственно. Мы благодарим Конрада Маллино (Лондонский университет Королевы Марии) и Поула Эрика Дженсена и Джули Аннемари Зита Зедлер (Копенгагенский университет) за плазмидный вектор и протокольные вклады и советы.

Materials

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) Thermo Fisher Scientific R0404 Used in 2.1.3.
Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt Sigma-Aldrich A2383 Used in Table 2.
Agar (microbiology tested) Sigma-Aldrich A1296-500g Used in 8.3.
Agarose Bioline BIO-41026 Used in 6.
Attune NxT Flow Cytometer Thermo Fisher Scientific – Used in 4.3.1.
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153 Used in Table 2.
BpiI (BbsI) Thermo Fisher Scientific ER1011 Used in Table 2.
BsaI (Eco31I) Thermo Fisher Scientific ER0291 Used in Table 2.
Carbenicillin disodium VWR International A1491.0005 Used in 2.1.3.
Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates Sigma-Aldrich CLS3527 Used in 4.1.3.
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Thermo Fisher Scientific BP231-100 Used in 3.6.2.
DNeasy Plant Mini Kit Qiagen 69104 DNA extraction kit. Used in 5.
FLUOstar Omega Microplate reader BMG Labtech – Used in 4.2.2.
GeneJET Plasmid Miniprep Kit Thermo Fisher Scientific K0503 Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2.
Glass beads (0.5 mm diameter) BioSpec Products 11079105 Used in 5.2.
Glycerol Thermo Fisher Scientific 10021083 Used in 2.3.1, 3.6.2.
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Thermo Fisher Scientific 10356553 Used in 2.1.3.
Kanamycin sulphate (Gibco) Thermo Fisher Scientific 11815-024 Used in 2.1.3.
Membrane filters (0.45 μm) MF-Millipore HAWP02500 Used in 3.3.7
Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEAR Greiner Bio-One 655096 Used in 4.2.1.
Monarch DNA Gel Extraction Kit New England Biolabs T1020S Used in 1.1.2.2.
Monarch PCR DNA Cleanup Kit New England Biolabs T1030 DNA purification kit. Used in 1.1.2.3.
Multitron Pro incubator with LEDs Infors HT – Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4.
MyTaq DNA Polymerase Bioline BIO-21108 Used in 7.1.
NanoDrop One Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W Used in 2.3.3.
One Shot TOP10 chemically competent E. coli Thermo Fisher Scientific C404010 Used in 2.1.1.
Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate) VWR International K813 Used in 4.3.2.
Q5High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0491S Used in 1.1.2.1.
Quick-Load 1 kb DNA Ladder New England Biolabs N0468S Used in Figure 4.
Screw-cap tubes (1.5 ml) Starstedt 72.692.210 Used in 3.6.3
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate VWR International J61820.06 Used in 2.1.3.
Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates Thermo Fisher Scientific 612U96 Used in 4.3.1.
T4 DNA ligase Thermo Fisher Scientific EL0011 Used in Table 2.
TissueLyser II Qiagen 85300 Bead mill. Used in 5.2.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Luan, G., Lu, X. Tailoring cyanobacterial cell factory for improved industrial properties. Biotechnology Advances. 36 (2), 430-442 (2018).
  2. Madsen, M. A., Semerdzhiev, S., Amtmann, A., Tonon, T. Engineering mannitol biosynthesis in Escherichia coli and Synechococcus sp. PCC 7002 using a green algal fusion protein. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2833-2840 (2018).
  3. Menin, B., et al. Non-endogenous ketocarotenoid accumulation in engineered Synechocystis sp. PCC 6803. Physiologia Plantarum. 166 (1), 403-412 (2019).
  4. Varman, A. M., Yu, Y., You, L., Tang, Y. J. Photoautotrophic production of D-lactic acid in an engineered cyanobacterium. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-8 (2013).
  5. Vavitsas, K., et al. Responses of Synechocystis sp. PCC 6803 to heterologous biosynthetic pathways. Microbial Cell Factories. 16, 140 (2017).
  6. Yang, G., et al. Photosynthetic production of sunscreen shinorine using an engineered cyanobacterium. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 664-671 (2018).
  7. Nielsen, A. Z., et al. Extending the biosynthetic repertoires of cyanobacteria and chloroplasts. Plant Journal. 87 (1), 87-102 (2016).
  8. Nielsen, J., Keasling, J. D. Engineering cellular metabolism. Cell. 164 (6), 1185-1197 (2016).
  9. Stensjö, K., Vavitsas, K., Tyystjärvi, T. Harnessing transcription for bioproduction in cyanobacteria. Physiologia Plantarum. 162 (2), 148-155 (2018).
  10. Santos-Merino, M., Singh, A. K., Ducat, D. C. New applications of synthetic biology tools for cyanobacterial metabolic engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 1-24 (2019).
  11. Lea-Smith, D. J., Vasudevan, R., Howe, C. J. Generation of marked and markerless mutants in model cyanobacterial species. Journal of Visualized Experiments. 111, e54001 (2016).
  12. Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
  13. Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile golden-gate framework towards universal DNA assembly. PLoS ONE. 13 (1), 1-18 (2018).
  14. Crozet, P., et al. Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo toolkit enabling synthetic biology in the microalga Chlamydomonas reinhardtii. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2074-2086 (2018).
  15. Engler, C., et al. A Golden Gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
  16. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  17. Pollak, B., et al. Loop assembly: a simple and open system for recursive fabrication of DNA circuits. New Phytologist. 222 (1), 628-640 (2019).
  18. Werner, S., Engler, C., Weber, E., Gruetzner, R., Marillonnet, S. Fast track assembly of multigene constructs using golden gate cloning and the MoClo system. Bioengineered Bugs. 3 (1), 38-43 (2012).
  19. Patron, N. J., et al. Standards for plant synthetic biology: a common syntax for exchange of DNA parts. New Phytologist. 208 (1), 13-19 (2015).
  20. Chao, R., Mishra, S., Si, T., Zhao, H. Engineering biological systems using automated biofoundries. Metabolic Engineering. 42, 98-108 (2017).
  21. Chambers, S., Kitney, R., Freemont, P. The Foundry: the DNA synthesis and construction Foundry at Imperial College. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 687-688 (2016).
  22. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  23. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Rare codon content affects the solubility of recombinant proteins in a codon bias-adjusted Escherichia coli strain. Microbial Cell Factories. 8, 1-9 (2009).
  24. Cambray, G., et al. Measurement and modeling of intrinsic transcription terminators. Nucleic Acids Research. 41 (9), 5139-5148 (2013).
  25. Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nature Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
  26. Münch, R., et al. Virtual Footprint and PRODORIC: An integrative framework for regulon prediction in prokaryotes. Bioinformatics. 21 (22), 4187-4189 (2005).
  27. Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nature Biotechnology. 27 (10), 946-950 (2009).
  28. Englund, E., Liang, F., Lindberg, P. Evaluation of promoters and ribosome binding sites for biotechnological applications in the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Scientific Reports. 6, 36640 (2016).
  29. Heidorn, T., et al. Synthetic biology in cyanobacteria engineering and analyzing novel functions. Methods in Enzymology. 497, 539-579 (2011).
  30. Thiel, K., et al. Translation efficiency of heterologous proteins is significantly affected by the genetic context of RBS sequences in engineered cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Microbial Cell Factories. 17, 34 (2018).
  31. Liu, Q., Schumacher, J., Wan, X., Lou, C., Wang, B. Orthogonality and burdens of heterologous and gate gene circuits in E. coli. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 553-564 (2018).
  32. Ferreira, E. A., et al. Expanding the toolbox for Synechocystis sp. PCC 6803: Validation of replicative vectors and characterization of a novel set of promoters. Synthetic Biology. (August), 1-39 (2018).
  33. Liang, F., Lindblad, P. Synechocystis PCC 6803 overexpressing RuBisCO grow faster with increased photosynthesis. Metabolic Engineering Communications. 4, 29-36 (2017).
  34. Taton, A., et al. Broad-host-range vector system for synthetic biology and biotechnology in cyanobacteria. Nucleic Acids Research. 42 (17), e136 (2014).
  35. Elhai, J., Wolk, C. P. Conjugal transfer of DNA to cyanobacteria. Methods in Enzymology. 167 (1984), 747-754 (1988).
  36. Gormley, E. P., Davies, J. Transfer of plasmid RSF1010 by conjugation from Escherichia coli to Streptomyces lividans and Mycobacterium smegmatis. Journal of Bacteriology. 173 (21), 6705-6708 (1991).
  37. Huang, H. H., Camsund, D., Lindblad, P., Heidorn, T. Design and characterization of molecular tools for a synthetic biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2577-2593 (2010).
  38. Huang, H. H., Lindblad, P. Wide-dynamic-range promoters engineered for cyanobacteria. Journal of Biological Engineering. 7, 10 (2013).
  39. Li, S., Sun, T., Xu, C., Chen, L., Zhang, W. Development and optimization of genetic toolboxes for a fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Metabolic Engineering. 48, 163-174 (2018).
  40. Pansegrau, W., Balzer, D., Kruft, V., Lurz, R., Lanka, E. In vitro assembly of relaxosomes at the transfer origin of plasmid RP4. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 87 (17), 6555-6559 (1990).
  41. Song, K., Tan, X., Liang, Y., Lu, X. The potential of Synechococcus elongatus UTEX 2973 for sugar feedstock production. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (18), 7865-7875 (2016).
  42. Waters, V. L., Guiney, D. G. Processes at the nick region link conjugation, T-DNA transfer and rolling circle replication. Molecular Microbiology. 9 (6), 1123-1130 (1993).
  43. Elhai, J., Vepritskiy, A., Muro-Pastor, A. M., Flores, E., Wolk, C. P. Reduction of conjugal transfer efficiency by three restriction activities of Anabaena sp. strain PCC 7120. Journal of Bacteriology. 179 (6), 1998-2005 (1997).
  44. Silva-Rocha, R., et al. The Standard European Vector Architecture (SEVA): A coherent platform for the analysis and deployment of complex prokaryotic phenotypes. Nucleic Acids Research. 41 (D1), D666-D675 (2013).
  45. Mandakovic, D., et al. CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization. Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).
  46. Masukawa, H., Inoue, K., Sakurai, H., Wolk, C. P., Hausinger, R. P. Site-directed mutagenesis of the Anabaena sp. strain PCC 7120 nitrogenase active site to increase photobiological hydrogen production. Applied and Environmental Microbiology. 76 (20), 6741-6750 (2010).
  47. Yu, J., et al. Synechococcus elongatus UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Scientific Reports. 5 (1), 8132 (2015).
  48. Ungerer, J., Wendt, K. E., Hendry, J. I., Maranas, C. D., Pakrasi, H. B. Comparative genomics reveals the molecular determinants of rapid growth of the cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 115 (50), E11761-E11770 (2018).
  49. Lepesteur, M., Martin, J. M., Fleury, A. A comparative study of different preservation methods for phytoplankton cell analysis by flow cytometry. Marine Ecology Progress Series. 93 (1-2), 55-63 (1993).
  50. Day, J. G. Cryopreservation of cyanobacteria. Cyanobacteria: An Economic perspective. , 319-327 (2014).
  51. Zhou, J., et al. Discovery of a super-strong promoter enables efficient production of heterologous proteins in cyanobacteria. Scientific Reports. 4, 4500 (2014).
  52. Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
  53. Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66, 174-176 (2006).
  54. Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6, 38828 (2016).
  55. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).

Tags

Genetic ModificationCyanobacteriaConjugationCyanoGateModular CloningSynthetic BiologyRenewable BiotechnologyTriparental MatingTransformationSynechocystisSynechococcusE. ColiHelper StrainPlasmids
check_url/it/60451?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Gale, G. A. R., Schiavon Osorio, A. A., Puzorjov, A., Wang, B., McCormick, A. J. Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit. J. Vis. Exp. (152), e60451, doi:10.3791/60451 (2019).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image