Real-time bioluminescens billeddannelse af notch signalering dynamik under murine Neurogenesis
Summary
Neurale Stem/stamceller udviser forskellige udtryks dynamik af notch signalerings komponenter, der fører til forskellige udfald af cellulære hændelser. Et sådant dynamisk udtryk kan afsløres ved realtidsovervågning, ikke ved statisk analyse, ved hjælp af et meget følsomt bioluminescens billedbehandlingssystem, der muliggør visualisering af hurtige ændringer i genudtryk.
Abstract
Notch signalering regulerer vedligeholdelsen af neurale stamme-/progenitorceller ved celle celle interaktioner. Komponenterne i notch signalering udviser dynamisk udtryk. Notch signalering Effector Hes1 og indhak ligand Delta-like1 (filen dll1) udtrykkes i en oscillerende måde i neurale stamceller/progenitorcellerne. Da perioden med det oscillatoriske udtryk for disse gener er meget kort (2 timer), er det vanskeligt at overvåge deres cykliske udtryk. For at undersøge sådanne hurtige ændringer i genekspression eller protein dynamik, er hurtige respons reportere påkrævet. På grund af sin hurtige modning kinetik og høj følsomhed, den bioluminescens reporter der er egnet til at overvåge hurtige genekspression ændringer i levende celler. Vi brugte en destabiliseret der Reporter til overvågning af arrangøren aktivitet og en der-smeltet reporter for visualisering af protein dynamik ved enkelt celle opløsning. Disse bioluminescens reportere viser hurtig omsætning og genererer meget svage signaler; Derfor har vi udviklet en meget følsom bioluminescens Imaging system til at detektere sådanne svage signaler. Disse metoder giver os mulighed for at overvåge forskellige genekspressions dynamik i levende celler og væv, som er vigtige oplysninger til at hjælpe med at forstå de faktiske cellulære stater.
Introduction
Den pattedyr hjerne består af et stort antal forskellige typer af neuroner og gliale celler. Alle celler genereres fra neurale stamme/stamceller (NPCs), som først formere sig for at udvide deres tal, derefter begynde at differentiere sig til neuroner, og endelig give anledning til gliaceller celler1,2,3,4,5. Når cellerne har differentieret i neuroner, kan de ikke formere sig eller øge deres antal, og derfor er vedligeholdelsen af NPC’erne indtil senere stadier vigtig. Notch signalering via celle-celle interaktioner spiller en vigtig rolle i at opretholde NPCs6,7. Notch ligander interagere med membran protein, hak, på overfladen af tilstødende celler og aktiverer hakket protein. Efter aktivering opstår proteolyse af hakket protein, hvorved det intracellulære domæne af hak (NiCd) frigives fra cellemembranen ind i kernen8,9,10. I kernen binder NICD sig til arrangøren regioner Hes1 og Hes5 (Hes1/5) og aktiverer ekspression af disse gener. Hes1/5 Tryk igen på ekspression af de proneurale gener Ascl1 og Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. Fordi proneurale gener inducerer neuronal differentiering, Hes1/5 spille væsentlige roller i at opretholde NPCs. Desuden, som proneurale gener kan aktivere ekspression af hak ligand Delta-like1 (filen dll1), Hes1/5 også undertrykke udtrykket af filen dll1. Derfor, udtrykket af filen dll1 fører til tilstødende celler er negativ for filen dll1 via notch signalering. På denne måde, celler hæmmer tilstødende celler fra at følge deres samme skæbne, et fænomen kendt som den laterale hæmning8. I den udviklende hjerne, lateral hæmning spiller en rolle i at generere forskellige forskellige celletyper.
Real-time Imaging på enkelt celleniveau afslører dynamiske udtryk af komponenterne i notch signalering i NPCs15,16,17. Notch signalering aktiverer ekspression af Hes1, men Hes1 protein binder sig til sin egen promotor og undertrykker sit eget udtryk. Desuden er Hes1 et ekstremt ustabilt protein, der nedbrydes af den ubiquitin-proteasome pathway; Derfor er undertrykkelsen af sin egen promotor kun kortvarig og derefter transskription starter igen. På denne måde, udtrykket af Hes1 svinger på både transskription og translationelle niveauer i en 2 h cyklus18. Den oscillatoriske udtryk for Hes1, til gengæld, inducerer den oscillatoriske udtryk for downstream Target gener, såsom Ascl1, Neurog2, og filen dll1, via periodisk undertrykkelse15,16,17,19. Mens proneurale gener kan inducere neuronal differentiering, deres oscillerende udtryk er ikke tilstrækkelig for neuronal differentiering; snarere deres vedvarende udtryk er afgørende for neuronal differentiering. Den oscillatoriske ekspression af proneurale gener er vigtig for at opretholde NPCs snarere end for inducerende neuronal differentiering14,15,16. Udtrykket af filen dll1 svinger ved både transkriptionen og translationelle niveauer under forskellige morfogenesis, såsom neurogenese og somitogenesis. Det dynamiske udtryk for filen dll1 er vigtigt for den normale morfogenesis og Steady Expression af filen dll1 inducerer defekter i neurogenese og somitogenesen17. Disse resultater viser den vigtige funktion, som dynamikken i genekspression og protein kinetik har på reguleringen af forskellige udviklingsmæssige hændelser (dvs. forskellige udtryks dynamikker producerer forskellige udgange i cellulær adfærd).
For at analysere dynamikken i notch signalering, den statiske analyse af væv og celler er utilstrækkelige, fordi de er i konstant forandring. Realtidsbilleder af enkeltceller er et effektivt værktøj til at afsløre dynamikken i genekspression. Det dynamiske udtryk for notch signalering molekyler gennemgår hurtige cykliske reaktioner i perioden 2-3 h. Denne hurtige periodiske udtryk præsenterer to vanskelige problemer for real-time overvågning: (1) udtrykket af molekyler er undertrykt til lave niveauer, og (2) hurtig omsætning kræver hurtig-respons journalister. For at overvinde disse problemer, har vi tidligere udviklet en bioluminescens real-time Imaging metode20. Fordi bioluminescens reporter har en højere følsomhed og kortere modningstid end fluorescerende journalister, denne strategi giver os mulighed for at overvåge den hurtige dynamik i levende celler. Ved hjælp af real-time visualisering, vi fandt, at flere gener udstillet dynamisk udtryk, end vi tidligere havde troet. Desuden er antallet af rapporter, der viser udtryk og protein dynamik i levende celler og betydningen af denne dynamik i forskellige biologiske begivenheder steget, hvilket tyder på en grundlæggende rolle i dynamikken i gene udtryk21,22.
I denne rapport beskriver vi en måde at visualisere udtrykket af den notch ligand filen dll1 i NPCs i både dissocierede kulturer og i kortikale skive kulturer. For at overvåge dynamikken i filen dll1 transskription på enkelt celle niveauer, genererede vi dissocierede kulturer af NPC’er afledt af embryonale telencephalon af Transgene mus transporterer pDll1-UB-fluc reporter, en filen dll1 promotor-drevet destabiliseret der reporter. For at overvåge filen dll1 protein dynamik in vivo introducerede vi filen dll1-Fluc fusion reporter i NPCs i cortex og visualiserede ekspression af journalisten i NPC’ere i kortikale skive kulturer. Real-time Imaging gjort det muligt for os at fange de forskellige funktioner i genekspression og protein dynamik i levende celler ved høj tidsmæssig opløsning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Komponenterne i notch signalering viser oscillatoriske udtryk i Synchrony under somitogenesen, men ud af Synchrony under neurogenese, hvilket fører til vanskelighederne med at opfange udtryks dynamikken ved statisk analyse i sidstnævnte tilfælde. Således, real-time overvågning er nødvendig for at afsløre udtrykket dynamik af notch signalering komponenter, såsom Hes1 og filen dll1. Fordi perioderne med udtrykkene Hes1 og filen dll1 svingninger er ekstremt korte, ca. 2-3 h, hurti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Yumiko Iwamoto for at støtte produktionen af videoen. Vi er også taknemmelig for at Akihiro Isomura til diskussion og støtter af billedanalyse, Hitoshi Miyachi for teknisk støtte til generering af transgene dyr, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Masatoshi Egawa (Olympus Medical Science), Takuya Ishizu ( Af Olympus Medical Science) og Ouin Kunitaki (Andor Japan) til teknisk støtte og diskussioner i bioluminescens billedbehandlingssystem. Dette arbejde blev støttet af kerneforskning inden for evolutions videnskab og teknologi (JPMJCR12W2) (R.K.), tilskud til videnskabelig forskning i innovative områder (MEXT 24116705 for H.S. og MEXT 16H06480 for R.K.), støtte til videnskabelig forskning (C) (JSPS 18K06254) (H.S.), Takeda Foundation (R.K. og H.S.), og platform for dynamiske tilgange til levende system fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi, Japan.
Materials
| Bioluminescence Imaging System | |||
| Chilled water circulator (chiller) | Julabo | Model: F12-ED | |
| Cooled CCD camera | Andor Technology | Model: iKon-M 934 | |
| Incubator system | TOKAI HIT | Model: INU-ONICS | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX81 | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX83 | |
| LED illumination device | CoolLED | Model: pE1 | |
| MetaMorph | MOLECULAR DEVICES | Model: 40000 | |
| Mix gas controller | Tokken | Model: TK-MIGM OLO2 | |
| Objective lens | Olympus | Model: UPLFLN 40X O | |
| Preparations for Dissection | |||
| Dissection microscope | Nikon | Model: SMZ-2B | |
| Fluorescence stereoscopic microscope | Leica | Model: MZ16FA | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Scissors, Micro scissors | |||
| Forceps | |||
| Ring-shaped forceps | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Reagents for NPC dissociation culture | |||
| B27 supplement | invitrogen | 12587-010 | |
| bFGF | invitrogen | 13256-029 | Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS |
| D-luciferin | Nacalai Tesque | 01493-85 | Stock solution: 100mM in 0.9% saline |
| DNase | Worthington Biochemical Corporation | LK003172 | Stock solution: 1000U/ml in EBSS |
| EBSS | Worthington Biochemical Corporation | LK003188 | |
| Glass bottom dish | IWAKI | 3910-035 | |
| N2 supplement (100x) | invitrogen | 17502-048 | |
| N-acetyl-cystein | Sigma | A-9165-25G | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LK003178 | Stock solution: 7U/ml in EBSS |
| Penicillin/Streptmycine | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P-6281 | 40 mg/ml in DW |
| Preparations for in utero electroporation | |||
| 50-ml syringe | TERUMO | 181228T | |
| Electrode | Neppagene | 7-mm | |
| Electroporator | Neppagene | CUY21 EDIT | |
| Forceps | |||
| Gauzes | Kawamoto co. | 7161 | |
| Micro capillary | Made in-house | ||
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Pentbarbital | Kyoritsuseiyaku | Somnopentyl | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Suture needle | Akiyama MEDICAL MFG. CO | F17-40B2 | |
| Xylazine | Bayer | Seractal | |
| Preparations for Slice culture | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| Culture insert | Millipore | PICM01250 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 172012-500ML | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Forceps | |||
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Micro surgical knife | Alcon | 19 Gauge V-Lance | |
| Multi-gas incubator | Panasonic | MCO-5MUV-PJ | |
| N2/B27 media | Made in-house | ref. NPC dissociatioin culture | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Silicon rubber cutting board | Made in-house |
Riferimenti
- Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. Basic helix-loop-helix factors in cortical development. Neuron. 39, 13-25 (2003).
- Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development. Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Paridaen, J. T., Huttner, W. B. Neurogenesis during development of the vertebrate central nervous system. EMBO Reports. 15, 351-364 (2014).
- Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. Notch signaling in vertebrate neural development. Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).
- Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks. Neuron. 69, 840-855 (2011).
- Bray, S. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
- Bray, S. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).
- Kopan, R., Ilagan, M. X. G. The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism. Cell. 137, 216-233 (2009).
- Ishibashi, M., et al. Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system. The EMBO Journal. 13, 1799-1805 (1994).
- Ohtsuka, T., et al. Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation. The EMBO Journal. 18, 2196-2207 (1999).
- Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F., Kageyama, R. Roles of the Basic Helix-Loop-Helix Genes Hes1 and Hes5 in Expansion of Neural Stem Cells of the Developing Brain. Journal of Biological Chemistry. 276, 30467-30474 (2001).
- Kageyama, R., Ohtsuka, T., Kobayashi, T. The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis. Development. 134, 1243-1251 (2007).
- Shimojo, H., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Oscillations in Notch Signaling Regulate Maintenance of Neural Progenitors. Neuron. 58, 52-64 (2008).
- Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Shimojo, H., et al. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes and Development. 30, 102-116 (2016).
- Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
- Kageyama, R., Ohtsuka, T., Shimojo, H., Imayoshi, I. Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition. Nature Neuroscience. 11, 1247-1251 (2008).
- Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1313-1318 (2006).
- Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342, 1193-1200 (2013).
- Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152, 945-956 (2013).
- Luker, G. D., Pica, C. M., Song, J., Luker, K. E., Piwnica-Worms, D. Imaging 26S proteasome activity and inhibition in living mice. Nature Medicine. 9, 969-973 (2003).
- Yamaguchi, S., et al. Synchronization of Cellular Clocks in the Suprachiasmatic Nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
- Kiyohara, Y. B., et al. The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).
- Behar, M., Hoffmann, A. Understanding the temporal codes of intra-cellular signals. Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic Gene Expression in a Single Cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
- Nelson, D. E., et al. Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression. Science. 306, 704-708 (2004).
- Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
- Hansen, A. S., O’Shea, E. K. Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression. Molecular Systems Biology. 9, 704 (2014).
- Hansen, A. S., O’Shea, E. K. cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale. Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).
- Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo. Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).
- Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: Progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
- Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay. Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).
- Nakajima, Y., et al. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, (2010).
- Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12, (2013).
