Une blessure de ballon segmental contrôlé par pression d’artère de rat carotide avec l’application thérapeutique periadventitial

Summary

La blessure de ballon d’artère carotide de rat imite la procédure clinique d’angioplastie exécutée pour reconstituer le flux sanguin dans les vaisseaux athérosclérostiques. Ce modèle induit la réponse artérielle de dommages en distendant la paroi artérielle, et en dénudant la couche intimal des cellules endothéliales, causant finalement le remodelage et une réponse hyperplastique intimale.

Abstract

Les maladies cardiovasculaires demeurent la principale cause de décès et d’invalidité dans le monde, en partie à cause de l’athérosclérose. La plaque athéroclérotique rétrécit la surface luminaire dans les artères réduisant ainsi le flux sanguin adéquat vers les organes et les tissus distals. Cliniquement, les procédures de revascularisation telles que l’angioplastie de ballon avec ou sans placement de stent visent à reconstituer le flux sanguin. Bien que ces procédures rétablissent le flux sanguin en réduisant le fardeau de la plaque, elles endommagent la paroi du vaisseau, ce qui déclenche la réponse artérielle de guérison. La réponse de guérison prolongée provoque une reposnose artérielle, ou re-rétrécissement, limitant finalement le succès à long terme de ces procédures de revascularisation. Par conséquent, les modèles animaux précliniques font partie intégrante de l’analyse des mécanismes pathophysiologiques qui conduisent la restenose, et offrent la possibilité de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les modèles Murine sont moins chers et plus faciles à utiliser que les grands modèles animaux. Les blessures par ballon ou par fil sont les deux modalités de blessures couramment acceptées utilisées dans les modèles murins. Les modèles de dommages de ballon en particulier imitent la procédure clinique d’angioplastie et causent des dommages proportionnés à l’artère pour le développement de la restenosis. Ci-après, nous décrivons les détails chirurgicaux pour effectuer et analyser histologiquement le modèle modifié et contrôlé par pression de dommages de ballon d’artère de rat. En outre, ce protocole met en évidence comment l’application périadventitiale locale des thérapeutiques peut être employée pour inhiber l’hyperplasie néointimale. Enfin, nous présentons la microscopie de fluorescence de feuille de lumière comme approche nouvelle pour l’imagerie et la visualisation des dommages artériaux dans trois dimensions.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires (MCV) demeurent la principale cause de décès dans le^{monde 1}. L’athérosclérose est la cause sous-jacente de la plupart des morbidités et mortalités liées aux MCV. L’athérosclérose est l’accumulation de plaque à l’intérieur des artères qui se traduit par un lumen rétréci, ce qui entrave la perfusion sanguine appropriée aux organes et aux tissus distals². Les interventions cliniques pour traiter l’athérosclérose grave incluent l’angioplastie de ballon avec ou sans placement de stent. Cette intervention consiste à faire avancer un cathéter de ballon jusqu’au site de la plaque et à gonfler le ballon pour comprimer la plaque jusqu’à la paroi artérielle, élargissant ainsi la zone luminaire. Cette procédure endommage l’artère, cependant, initiant la réponse artérielle de dommages³. L’activation prolongée de cette réponse de blessure mène à la restenosis artérielle, ou re-rétrécissement, secondaire à l’hyperplasie néointimale et au remodelage de navire. Pendant l’angioplastie, la couche intimale est dénudée des cellules endothéliales menant au recrutement immédiat de plaquettes et à l’inflammation locale. La signalisation locale induit des changements phénotypiques dans les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC) et les fibroblastes adventitiels. Cela conduit à la migration et la prolifération de VSMC et fibroblastes vers l’intérieur vers le lumen, conduisant à l’hyperplasie néointimale^4,5. Les cellules progénitrices circulants et les cellules immunitaires contribuent également au volume global de restenose^6. Le cas échéant, les endosseurs d’échappement de médicaments (DES) sont la norme actuelle pour inhiber la restenose⁷. Des inhiber la ré-endothélialisation artérielle, cependant, créant ainsi un environnement pro-thrombotic qui peut avoir comme conséquence la thrombose tard dans-stent^8. Par conséquent, les modèles animaux font partie intégrante à la fois pour comprendre la pathophysiologie de la restenose, et pour développer de meilleures stratégies thérapeutiques pour prolonger l’efficacité des procédures de revascularisation.

Plusieurs grands et petits modèles^{animaux 9} sont utilisés pour étudier cette pathologie. Il s’agit notamment^{de ballon-blessure 3,10} ou wire-blessure¹¹ du côté luminal d’une artère, ainsi que la ligature partielle¹² ou le placement de manchette¹³ autour de l’artère. Les dommages de ballon et de fil denudent la couche endothéliale de l’artère, imitant ce qui se produit médicalement après angioplastie. En particulier, les modèles de ballons-blessures utilisent des outils similaires à ceux du milieu clinique (c.-à-d. cathéter ballon). La blessure de ballon est mieux exécutée dans les modèles de rat, car les artères de rat sont une taille appropriée pour les cathéters disponibles dans le commerce de ballon. Nous décrivons ici une blessure artérielle segmentale contrôlée par pression, une version bien établie et modifiée de la blessure de ballon d’artère carotide de rat. Cette approche contrôlée par pression imite étroitement la procédure clinique d’angioplastie, et permet la formation néointimal reproductible d’hyperplasie deux semaines^{après blessure 14,15.} En outre, cette blessure artérielle contrôlée par pression a comme résultat la restauration complète de couche endothéliale par 2 semaines après chirurgie^16. Cela contraste directement avec le modèle original de blessure de ballon, décrit par Clowes, où la couche endothéliale ne revient jamais à la couverture complète³.

Après la chirurgie, des thérapeutiques peuvent être appliquées ou dirigées vers l’artère blessée par plusieurs approches. La méthode décrite ci-après utilise l’application périadventitiale d’une petite molécule intégrée dans une solution de gel pluronique. Plus précisément, nous appliquons une solution d’aldéhyde cimnamic de 100 μM dans le gel Pluronic-F127 de 25% à l’artère immédiatement après blessure pour inhiber la formation néointimale d’hyperplasie^15. Pluronic-F127 est un gel thermoréversible non toxique capable de livrer des médicaments localement d’une manière contrôlée¹⁷. Pendant ce temps, les lésions artérielles sont locales, d’où l’administration locale permet de tester un principe actif tout en minimisant les effets hors cible. Néanmoins, la livraison efficace d’une thérapeutique utilisant cette méthode dépendra de la chimie de la petite molécule ou biologique utilisée.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill. 1. Procédures préopératoires Stériliser les instruments chirurgicaux. Autoclave tous les instruments chirurgicaux avant la chirurgie. Si vous effectuez plusieurs interventions chirurgicales le même jour, stérilisez les instruments entre les chirurgies à l’aide d’un stérilisateur de perles sèches. …

Representative Results

La figure 1 montre tous les matériaux et les outils chirurgicaux utilisés pour effectuer cette chirurgie. L’hématoxyline et l’éosine (H&E) soudant des sections artérielles transversales blessées de deux semaines permettent une visualisation claire de l’hyperplasie néointimale. La figure 2 montre des images représentatives de sections artérielles tachées de H&E d’une artère saine, blessée et traitée. La figure 2 …

Discussion

La blessure de ballon d’artère carotide de rat est l’un des modèles animaux de restnosis les plus largement utilisés et étudiés. Le modèle original de blessure de^{ballon 3 et} la variation segmentaire modifiée de dommages segmentaires sous pression¹⁰ ont informé beaucoup d’aspects de la réponse artérielle de dommages qui se produit également chez l’homme, avec les quelques limitations étant que le thrombus fibrin-riche se développe rarement et l’inflamm…

Materials

1 mL Syringe	Fisher	14955450
1 mL Syringe with needle	BD	309626
2 French Fogarty Balloon Embolectomy Catheter	Edwards LifeSciences	120602F
4-0 Ethilon (Nylon) Suture	Ethicon Inc	662H
4-0 Vicryl Suture	Ethicon Inc	J214H
7-0 Prolene Suture	Ethicon Inc	8800H
70% ethyl alcohol
Anti-Rabbit Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A21245
Atropine Sulfate	Vedco Inc		for veterinary use
Cotton Swabs	Puritan	806-WC
Curved Hemostats	Fine Science Tools	13009-12
Fine Curved Forceps	Fine Science Tools	11203-25
Fine Scissors	Fine Science Tools	14090-11
Gauze	Covidien	2252
IHC-Tek Diluent (pH 7.4)	IHC World	IW-1000
Insufflator	Merit Medical	IN4130
Iodine solution
Lubricating Eye Ointment	Dechra		for veterinary use
Mayo Scissors	Fine Science Tools	14010-15
Micro Serrefines	Fine Science Tools	18055-05
Microdissection Scissors	Fine Science Tools	15004-08
Micro-Serrefine Clamp Applying Forceps	Fine Science Tools	18057-14
Needle Holder	Fine Science Tools	12003-15
Pluronic-127 (diluted in sterile water)	Sigma-Aldrich	P2443	25% prepared
Rabbit Anti-CD31	Abcam	ab28364
Retractor			Bent paper clips work well
Rimadyl (Carprofen)	Zoetis Inc		for veterinary use
Saline solution
Standard Forceps	Fine Science Tools	11006-12
Sterile Drape	Dynarex	4410
T-Pins