Una lesione segmentale del palloncino segmentale controllato dalla pressione carotide del ratto con applicazione terapeutica periadventitiale

Summary

La lesione del palloncino dell’arteria carotide del ratto imita la procedura di angioplastica clinica eseguita per ripristinare il flusso sanguigno nei vasi aterosclerotici. Questo modello induce la risposta alle lesioni arteriose tendendo la parete arteriosa e denudendo lo strato intimale delle cellule endoteliali, causando infine rimodellamento e una risposta iperplastica intimale.

Abstract

Le malattie cardiovascolari rimangono la principale causa di morte e disabilità in tutto il mondo, in parte a causa dell’aterosclerosi. La placca aterosclerotica restringe la superficie luminare nelle arterie riducendo così un adeguato flusso sanguigno agli organi e ai tessuti distali. Clinicamente, le procedure di rivascolarizzazione come l’angioplastica del palloncino con o senza posizionamento dello stent mirano a ripristinare il flusso sanguigno. Sebbene queste procedure ristabiliscono il flusso sanguigno riducendo il carico della placca, danneggiano la parete del vaso, che avvia la risposta di guarigione arteriosa. La risposta curativa prolungata causa la restenosi arteriosa, o restringimento, limitando infine il successo a lungo termine di queste procedure di rivascolarizzazione. Pertanto, i modelli animali preclinici sono parte integrante per l’analisi dei meccanismi fisiopatologici che guidano la restenosi e offrono l’opportunità di testare nuove strategie terapeutiche. I modelli Murine sono più economici e facili da usare rispetto ai grandi modelli animali. Le lesioni da palloncino o filo sono le due modalità di lesione comunemente accettate utilizzate nei modelli murini. I modelli di lesioni da palloncino in particolare imitano la procedura di angioplastica clinica e causano danni adeguati all’arteria per lo sviluppo della restenosi. Qui descriviamo i dettagli chirurgici per eseguire e analizzare istologicamente il modello modificato di lesione del palloncino carotide del ratto controllato a pressione. Inoltre, questo protocollo evidenzia come l’applicazione periadventitiale locale delle terapie può essere utilizzata per inibire l’iperplasia neointimica. Infine, presentiamo la microscopia a fluorescenza della scheda luminosa come un nuovo approccio per l’imaging e la visualizzazione della lesione arteriosa in tre dimensioni.

Introduction

Le malattie cardiovascolari (CVD) rimangono la principale causa di morte in tutto il^{mondo 1}. L’aterosclerosi è la causa alla base della morbilità e della mortalità legate alla CVD. L’aterosclerosi è l’accumulo di placca all’interno delle arterie che si traduce in un lume ristretto, ostacolando una corretta perfusione sanguigna agli organi e ai tessuti distali². Gli interventi clinici per il trattamento dell’aterosclerosi grave includono angioplastica a palloncino con o senza posizionamento dello stent. Questo intervento prevede l’avanzamento di un catetere a palloncino verso il sito della placca e l’gonfiamento del palloncino per comprimere la placca alla parete arteriosa, allargando l’area luminare. Questa procedura danneggia l’arteria, tuttavia, avviando la risposta alle lesioni arteriosa³. L’attivazione prolungata di questa risposta alle lesioni porta alla restenosi arteriosa, o restringimento, secondaria all’iperplasia neointimica e al rimodellamento dei vasi. Durante l’angioplastica lo strato intimale viene denudato di cellule endoteliali che portano al reclutamento immediato delle piastrine e all’infiammazione locale. La segnalazione locale induce cambiamenti fenotipiche nelle cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) e nei fibroblasti accidentali. Ciò porta alla migrazione e alla proliferazione di VSMC e fibroblasti verso l’interno verso il lume, portando all’iperplasia neointimica^4,5. Le cellule progenitrici circolanti e le cellule immunitarie contribuiscono anche al volume complessivo della restenosi⁶. Se del caso, gli stent di eluizione dei farmaci (DES) sono lo standard attuale per inibire la restenosi⁷. Il DES inibisce la rialtelializzazione arteriosa, tuttavia, creando così un ambiente pro-trombotico che può causare trombosi late in-stent⁸. Pertanto, i modelli animali sono parte integrante sia per comprendere la fisiopatologia della restenosi, sia per sviluppare migliori strategie terapeutiche per prolungare l’efficacia delle procedure di rivascolarizzazione.

Diversi modelli animali grandi e^{piccoli 9} sono utilizzati per studiare questa patologia. Questi includono la lesione del^{palloncino 3,10} o lesione del^{filo 11} del lato luminare di un’arteria, così come la legatura parziale^{12 o il posizionamento} del polsino¹³ intorno all’arteria. Il palloncino e la lesione del filo denudano entrambi lo strato endoteliale dell’arteria, imitando ciò che accade clinicamente dopo l’angioplastica. In particolare, i modelli di lesioni da palloncino utilizzano strumenti simili a quello dell’ambiente clinico (ad esempio, catetere a palloncino). La lesione del palloncino è meglio eseguita nei modelli di ratti, poiché le arterie del ratto sono di dimensioni appropriate per i cateteri a palloncino disponibili in commercio. Qui descriviamo una lesione arteriosa segmentale controllata dalla pressione, una versione ben consolidata e modificata della lesione del palloncino dell’arteria carotide del ratto. Questo approccio controllato dalla pressione imita da vicino la procedura di angioplastica clinica e consente la formazione di iperplasia neointimica riproducibile due settimane dopo la^{lesione 14,15}. Inoltre, questa lesione arteriosa controllata dalla pressione si traduce in un completo ripristino dello strato endoteliale entro 2 settimane dall’intervento^{chirurgico 16}. Ciò contrasta direttamente con il modello originale di lesione del palloncino, descritto da Clowes, dove lo strato endoteliale non ritorna mai alla copertura^{completa 3}.

Dopo l’intervento chirurgico, le terapie possono essere applicate o dirette verso l’arteria ferita attraverso diversi approcci. Il metodo descritto nel presente documento utilizza l’applicazione periadivenzionale di una piccola molecola incorporata in una soluzione di gel pluronico. Nello specifico, applichiamo una soluzione di aldeide cinnamica da 100 μM nel gel Pluronic-F127 al 25% all’arteria immediatamente dopo la lesione per inibire la formazione di iperplasia neointimica¹⁵. Pluronic-F127 è un gel atossico e termo-reversibile in grado di fornire farmaci localmente in modo controllato¹⁷. Nel frattempo, le lesioni arteriosa sono locali, quindi l’amministrazione locale consente di testare un principio attivo riducendo al minimo gli effetti fuori bersaglio. Tuttavia, l’erogazione efficace di una terapia utilizzando questo metodo dipenderà dalla chimica della piccola molecola o del biologico utilizzato.

Protocol

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell’Università della Carolina del Nord a Chapel Hill. 1. Procedure preoperatorie Sterilizzare gli strumenti chirurgici. Autoclave tutti gli strumenti chirurgici prima dell’intervento chirurgico. Se si eseguono più interventi chirurgici lo stesso giorno, sterilizzare gli strumenti tra gli interventi chirurgici utilizzando uno sterilizzatore di perline secche. Prepara…

Representative Results

La figura 1 mostra tutti i materiali e gli strumenti chirurgici utilizzati per eseguire questo intervento chirurgico. La colorazione di ematossilina ed eosina (H&E) di sezioni trasversali arteriosa ferite di due settimane consente una chiara visualizzazione dell’iperplasia neointimica. La figura 2 mostra immagini rappresentative di sezioni trasversali arteriosa macchiate di H&E di un’arteria sana, ferita e trattata. La figura 2 desc…

Discussion

La lesione del palloncino dell’arteria carotide di ratto è uno dei modelli animali di restenosi più ampiamente utilizzati e studiati. Sia la lesione del palloncino originale^{modello 3} che la variazione di lesione segmentale controllata dalla pressione^{modificata 10 hanno} informato molti aspetti della risposta alle lesioni arteriosa che si verifica anche nell’uomo, con le poche^limitazioniche il trombo ricco di fibrina si sviluppa raramente e l’infiamm…

Materials

1 mL Syringe	Fisher	14955450
1 mL Syringe with needle	BD	309626
2 French Fogarty Balloon Embolectomy Catheter	Edwards LifeSciences	120602F
4-0 Ethilon (Nylon) Suture	Ethicon Inc	662H
4-0 Vicryl Suture	Ethicon Inc	J214H
7-0 Prolene Suture	Ethicon Inc	8800H
70% ethyl alcohol
Anti-Rabbit Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A21245
Atropine Sulfate	Vedco Inc		for veterinary use
Cotton Swabs	Puritan	806-WC
Curved Hemostats	Fine Science Tools	13009-12
Fine Curved Forceps	Fine Science Tools	11203-25
Fine Scissors	Fine Science Tools	14090-11
Gauze	Covidien	2252
IHC-Tek Diluent (pH 7.4)	IHC World	IW-1000
Insufflator	Merit Medical	IN4130
Iodine solution
Lubricating Eye Ointment	Dechra		for veterinary use
Mayo Scissors	Fine Science Tools	14010-15
Micro Serrefines	Fine Science Tools	18055-05
Microdissection Scissors	Fine Science Tools	15004-08
Micro-Serrefine Clamp Applying Forceps	Fine Science Tools	18057-14
Needle Holder	Fine Science Tools	12003-15
Pluronic-127 (diluted in sterile water)	Sigma-Aldrich	P2443	25% prepared
Rabbit Anti-CD31	Abcam	ab28364
Retractor			Bent paper clips work well
Rimadyl (Carprofen)	Zoetis Inc		for veterinary use
Saline solution
Standard Forceps	Fine Science Tools	11006-12
Sterile Drape	Dynarex	4410
T-Pins