Una lesión de globo segmentario controlada por presión arterial carótida de rata con aplicación terapéutica periavential

Summary

La lesión del globo arterial carótido de rata imita el procedimiento clínico de angioplastia realizado para restaurar el flujo sanguíneo en vasos ateroscleróticos. Este modelo induce la respuesta a lesiones arteriales al desprestir la pared arterial, y desnudar la capa intimal de las células endoteliales, causando en última instancia remodelación y una respuesta hiperplástica intimal.

Abstract

Las enfermedades cardiovasculares siguen siendo la principal causa de muerte y discapacidad en todo el mundo, en parte debido a la aterosclerosis. La placa aterosclerótica estrecha la superficie luminal en las arterias, reduciendo así el flujo sanguíneo adecuado a órganos y tejidos distales. Clínicamente, los procedimientos de revascularización como la angioplastia con o sin colocación de stent tienen como objetivo restaurar el flujo sanguíneo. Aunque estos procedimientos restablecen el flujo sanguíneo reduciendo la carga de la placa, dañan la pared del vaso, lo que inicia la respuesta de curación arterial. La respuesta curativa prolongada causa restenosis arterial, o rea estrechamiento, limitando en última instancia el éxito a largo plazo de estos procedimientos de revascularización. Por lo tanto, los modelos animales preclínicos son integrales para analizar los mecanismos fisiológicos que impulsan la restenosis, y proporcionan la oportunidad de probar nuevas estrategias terapéuticas. Los modelos murinos son más baratos y fáciles de operar que los modelos animales grandes. Las lesiones por balón o alambre son las dos modalidades de lesiones comúnmente aceptadas utilizadas en modelos murinos. Los modelos de lesiones por balón en particular imitan el procedimiento de angioplastia clínica y causan daños adecuados a la arteria para el desarrollo de la restenosis. Aquí describimos los detalles quirúrgicos para realizar y analizar histológicamente el modelo modificado de lesión del globo arterial carótido de rata controlado por presión. Además, este protocolo destaca cómo la aplicación periavential local de terapias se puede utilizar para inhibir la hiperplasia neointimal. Por último, presentamos la microscopía de fluorescencia de la hoja de luz como un enfoque novedoso para la toma de imágenes y la visualización de la lesión arterial en tres dimensiones.

Introduction

Las enfermedades cardiovasculares (ECV) siguen siendo la principal causa de muerte en todo el mundo^1. La aterosclerosis es la causa subyacente de la mayor parte de la morbilidad y mortalidad relacionadas con la ECV. La aterosclerosis es la acumulación de placa dentro de las arterias que resulta en un lumen estrechado, dificultando la perfusión adecuada de sangre a los órganos y tejidos distales^2. Las intervenciones clínicas para el tratamiento de la aterosclerosis grave incluyen angioplastia con o sin colocación de stent. Esta intervención consiste en avanzar un catéter de globo hacia el lugar de la placa, e inflar el globo para comprimir la placa a la pared arterial, ensanchando el área luminal. Este procedimiento daña la arteria, sin embargo, iniciando la respuesta a lesiones arteriales³. La activación prolongada de esta respuesta a lesiones conduce a la restenosis arterial, o rea estrechamiento, secundaria a la hiperplasia neointimal y la remodelación de los vasos. Durante la angioplastia, la capa intimal se denuda de células endoteliales que conducen al reclutamiento inmediato de plaquetas y a la inflamación local. La señalización local induce cambios fenotípicos en las células musculares lisas vasculares (VSMC) y fibroblastos adventitiales. Esto conduce a la migración y proliferación de VSMC y fibroblastos hacia adentro hacia el lumen, lo que conduce a la hiperplasia neointimal^4,5. Las células progenitoras circulantes y las células inmunes también contribuyen al volumen total de restenosis^6. En su caso, los stents que eluden fármacos (DES) son el estándar actual para inhibir la restenosis^7. Sin embargo, el DES inhibe la redotelización arterial, creando así un ambiente pro-trombótico que puede resultar en trombosis tardía en el stent^8. Por lo tanto, los modelos animales son integrales tanto para entender la fisiopatología de la restenosis, como para desarrollar mejores estrategias terapéuticas para prolongar la eficacia de los procedimientos de revascularización.

Varios modelos animales grandes y pequeños⁹ se utilizan para estudiar esta patología. Estos incluyen lesión de balón^3,10 o lesión de alambre¹¹ del lado luminal de una arteria, así como ligadura parcial¹² o colocación del manguito¹³ alrededor de la arteria. Tanto el balón como la lesión del alambre denudan la capa endotelial de la arteria, imitando lo que ocurre clínicamente después de la angioplastia. En particular, los modelos de lesiones por balón utilizan herramientas similares a las del entorno clínico (es decir, catéter de globo). La lesión del globo se realiza mejor en modelos de ratas, ya que las arterias de rata son de un tamaño adecuado para los catéteres de globo disponibles comercialmente. Aquí describimos una lesión arterial segmental controlada por presión, una versión bien establecida y modificada de la lesión del globo arterial carótido de rata. Este enfoque controlado por presión imita estrechamente el procedimiento de angioplastia clínica, y permite la formación reproducible de hiperplasia neointimal dos semanas después de la lesión^14,15. Además, esta lesión arterial controlada por presión resulta en una restauración completa de la capa endotelial 2 semanas después de la cirugía^16. Esto contrasta directamente con el modelo original de lesiones en globo, descrito por Clowes, donde la capa endotelial nunca vuelve a la cobertura completa^3.

Después de la cirugía, las terapias pueden aplicarse o dirigirse hacia la arteria lesionada a través de varios enfoques. El método descrito aquí utiliza la aplicación periavential de una molécula pequeña incrustada en una solución de gel plurónico. En concreto, aplicamos una solución de 100 μM de aldehído cinámico en gel Pluronic-F127 al 25% inmediatamente después de una lesión para inhibir la formación de hiperplasia neointimal^15. Pluronic-F127 es un gel termo reversible no tóxico capaz de suministrar medicamentos localmente de forma controlada^17. Mientras tanto, la lesión arterial es local, por lo tanto la administración local permite probar un principio activo mientras minimiza los efectos fuera del objetivo. Sin embargo, la entrega efectiva de un método terapéutico con este método dependerá de la química de la molécula pequeña o biológico utilizado.

Protocol

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill. 1. Procedimientos preoperatorios Esterilizar instrumentos quirúrgicos. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos antes de la cirugía. Si realiza varias cirugías el mismo día, esterilizar instrumentos entre cirugías utilizando un esterilizador de cuentas secas. Preparar terapéutico en gel Plu…

Representative Results

La Figura 1 muestra todos los materiales y herramientas quirúrgicas utilizadas para realizar esta cirugía. La tinción de hematoxilina y eosina (H&E) de secciones transversales arteriales lesionadas de dos semanas permite una visualización clara de la hiperplasia neointimal. La Figura 2 muestra imágenes representativas de las secciones transversales arteriales manchadas de H&E de una arteria sana, herida y tratada. La Figura 2 t…

Discussion

La lesión del globo arterial carótido de rata es uno de los modelos animales de restenosis más utilizados y estudiados. Tanto el modelo original de lesión de globo³ como la variación de lesiones segmentales modificada controlada por presión¹⁰ han informado de muchos aspectos de la respuesta a lesiones arteriales que también se produce en los seres humanos, siendo las pocas limitaciones que rara vez se desarrolla el trombo rico en fibrina y la inflamación local es m?…

Materials

1 mL Syringe	Fisher	14955450
1 mL Syringe with needle	BD	309626
2 French Fogarty Balloon Embolectomy Catheter	Edwards LifeSciences	120602F
4-0 Ethilon (Nylon) Suture	Ethicon Inc	662H
4-0 Vicryl Suture	Ethicon Inc	J214H
7-0 Prolene Suture	Ethicon Inc	8800H
70% ethyl alcohol
Anti-Rabbit Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A21245
Atropine Sulfate	Vedco Inc		for veterinary use
Cotton Swabs	Puritan	806-WC
Curved Hemostats	Fine Science Tools	13009-12
Fine Curved Forceps	Fine Science Tools	11203-25
Fine Scissors	Fine Science Tools	14090-11
Gauze	Covidien	2252
IHC-Tek Diluent (pH 7.4)	IHC World	IW-1000
Insufflator	Merit Medical	IN4130
Iodine solution
Lubricating Eye Ointment	Dechra		for veterinary use
Mayo Scissors	Fine Science Tools	14010-15
Micro Serrefines	Fine Science Tools	18055-05
Microdissection Scissors	Fine Science Tools	15004-08
Micro-Serrefine Clamp Applying Forceps	Fine Science Tools	18057-14
Needle Holder	Fine Science Tools	12003-15
Pluronic-127 (diluted in sterile water)	Sigma-Aldrich	P2443	25% prepared
Rabbit Anti-CD31	Abcam	ab28364
Retractor			Bent paper clips work well
Rimadyl (Carprofen)	Zoetis Inc		for veterinary use
Saline solution
Standard Forceps	Fine Science Tools	11006-12
Sterile Drape	Dynarex	4410
T-Pins