אוסף של אזורים קפואים המוח מכרסם עבור ניתוח במורד הזרם
Summary
הליך זה מתאר את אוסף אזורי המוח קפוא בנפרד כדי להשיג חלבון באיכות גבוהה ו-RNA באמצעות כלים זולים וזמינים בדרך כלל.
Abstract
כמו ההבנה שלנו של נוירוביולוגיה התקדמה, ניתוחים מולקולריים מבוצעים לעתים קרובות על אזורים במוח קטן כגון קליפת האמצעי המדינטלית (mPFC) או גרעין accumbens. האתגר בעבודה זו הוא לנתח את השטח הנכון תוך שמירה על המיקרו-סביבה להיבדק. במאמר זה, אנו מתארים שיטה פשוטה, בעלות נמוכה באמצעות משאבים זמינים ברוב המעבדות. שיטה זו שומרת על חומצת גרעין וחלבונים על ידי שמירה על הרקמה הקפואה לאורך כל התהליך. המוח הם חתכו לתוך 0.5 – 1.0 מקטעים באמצעות מטריצה המוח מסודרים על צלחת זכוכית קפואה. ציוני דרך בכל מקטע מושווים להפניה, כגון אטלס המוח של אלן העכבר, והאזורים הם גזור באמצעות איזמל קר או אגרוף ביופסיה. הרקמה מאוחסנת לאחר מכן ב-80 ° צ’ עד השימוש. באמצעות זה עכברוש ועכבר התהליך mPFC, גרעין accumbens, ההיפוקמפוס והיפוגולי ואזורים אחרים נותחו בהצלחה באמצעות רביעיית-PCR ומערב assays. שיטה זו מוגבלת לאזורי מוח שניתן לזהותה באמצעות ציוני דרך ברורים.
Introduction
עבודה זו ממחישה את הניתוח של אזורי המוח קפוא להפקת חומצה גרעין באיכות גבוהה או חלבון באמצעות התייחסות, כגון המוח העכבר אלן אטלס1, כמדריך. בטכניקה זו, המוחות מוקפאים ומאוחסנים ב-80 ° c לצורך הצבה מאוחרת יותר ולאחר החיתוך תוך כדי תחזוקה במצב קפוא. תהליך זה מאפשר לחוקר לקצור מספר רב של מוחות בפגישה אחת ולאחר מכן לנתח אותם לאוסף מדויק של אזורי מוח מרובים.
האוסף המדויק של אזורי המוח המעניינים (ROIs) נדרש לעתים קרובות כאשר מענות על שאלות הקשורות לביטוי הגן והחלבון. בעוד פרמקולוגיה, אלקטרופיזיולוגיה ו אלקטרואופטיקה ניתן להשתמש על סוג wildtype מכרסמים מהונדסים גנטית כדי לעזור להבהיר שינויים מולקולריים הצמדת התנהגויות שנצפו2,3,4, המדידה של שינויים המושרה ב transcript ו פרוטמס משמש לעתים קרובות כדי לתמוך בממצאים אלה. טכניקות כגון שעתוק הפוכה כמותית תגובת שרשרת פולימראז (RT-qPCR), בלוק מערבי, RNAseq5, mapseq6 ו כדיקות7 הם חזקים יחסית נמוך בעלות, המאפשר מעבדות רבות ללמוד שינויים מולקולריים המושרה בתוך מחוזות המוח הקטן2,4,5,6.
ישנן מספר דרכים כדי לחלץ ולטהר חומצות גרעין או חלבון מאזורי המוח8,9,10,11,12. מעבדות רבות הקציר אזורי המוח על ידי מצמרר וחיתוך המוח על הקרח בזמן הקציר9,13. בעוד גישה זו יכולה לגרום חומצה גרעין באיכות גבוהה וחלבון, זה קצת זמן מוגבל כמו השפלה בתוך מיקרוסביבה של הרקמה עשויה להתרחש בטמפרטורות אלה. זה יכול להיות נכון במיוחד כאשר מנסים לנתח מספר גדול של בעלי חיים או ROIs בישיבה אחת. שמירה על דגימות קפוא מסייע לשמור יציב משך מולקולות היעד תוך מתן זמן החוקר להשוות בקפידה ציוני דרך משני הצדדים של כל קטע במאמץ לאסוף דגימות טהור יחסית. לכידת לייזר היא דרך נוספת לאסוף רקמות עבור RNA או ניתוח חלבון מאזורי המוח10. הליך זה הוא מעולה לניתוח מכני באותו ROIs קטן מאוד בצורה לא סדירה ניתן לזהות ולבודד. עם זאת, לכידת לייזר מוגבל על ידי שימוש של ציוד יקר ריאגנטים, הוא זמן רב ועלול גם להיות פגיע יותר לירידה במדגם.
ניתוח micropunch ‘ על רקמות קפואות הוא לא חדש. מאמרים מוקדמים של מיקלוס פאלקוביץ ‘ ואחרים מתארים את הטכניקות הבסיסיות בפירוט14,15. מצגת זו בעיקר לאחר העבודה המקורית, עם כמה שיפורים כדי להקל על היעילות ולהקטין את ההוצאות של הציוד הדרוש. למשל, מקטעים מהמוח נעשים בבלוק מוחי קפוא ולא בקריוסטט. זה מייצר סעיפים עבה יותר אשר מפחית את מספר הסעיפים הדרושים כדי לאסוף דגימות ROI. שיטה זו גם מבתר דגימות על צלחת זכוכית קפואה שיושבת על קרח יבש בתוך קופסה מבודדת. זה יוצר שלב מקפיא בספסל שעליו לעבוד. מקטעים גזור בדרך זו הם מניקל בקלות לתרגום, המאפשר לחוקר להשוות את שני הצדדים של כל מקטע עם התייחסות על מנת להגביל את הזיהום מאזורים מחוץ ROI הרצוי.
היתרונות של פרוטוקול זה הם 1) המוח נשמר במצב קפוא לאורך כל התהליך, אשר מסייע לשמר את חומצות החלבון והגרעין ונותן את הזמן החוקר ROIs הקציר בזהירות, ו 2) ריאגנטים נדרש הם זולים נמצאים במעבדות הביולוגיה המולקולרית ביותר. בתהליך זה, מוחות שלמים מנות עד 0.5-1.0 מ”מ במטריצת מוח ומניחים על צלחת זכוכית קפואה כי הוא מקורר ברציפות עם קרח יבש. ציוני דרך שנמצאו במוח אלן אטלס1 או אטלסים המוח אחרים16,17 משמשים כדי לזהות אזורים של עניין, אשר לאחר מכן לגזור באמצעות אגרוף קר או אזמל. כי הרקמה מעולם לא הופפה, אזורים שנקטפו באופן זה לספק באיכות גבוהה RNA וחלבונים עבור ניתוחי במורד הזרם.
Protocol
Representative Results
Discussion
עבודה זו מתארת טכניקה לבודד אזורים קטנים וספציפיים של המוח תוך הגבלת השפלה של חומצת גרעין וחלבונים. נזק לרקמות המוח קורה. במהירות ברגע שאורגניזם מת זה באופן חלקי בשל הצטברות מהירה של גלוטמט החילוץ ואת ההתרגשות הנובעת שמתרחשת21. שליח RNA פגיע במיוחד להשפלה22,<sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי ה-NIH, DA043982 ו-DA046196.
Materials
| 0.5 mm Mouse coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 505C | Cutting block |
| 0.5 mm Rat coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 705C | Cutting block |
| 1.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-01 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Dot Scientific | 229443 | For storing frozen ROIs |
| 1.5 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-02 | |
| 2.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-03 | |
| 4-12% NuPage gel | Invitrogen | NPO323BOX | protein gradient gel |
| Bioanalyzer System | Agilent | 2100 | RNA analysis system |
| Dounce tissue grinder | Millipore Sigma | D8938 |
Glass tissue homogenizer |
| Dry Ice | |||
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner Industries Inc. | Model 180 | Cool lamp |
| Glass plates | LabRepCo | 11074010 | |
| HALT | ThermoFisher | 78440 | protease inhibitor cocktail |
| Low profile blades | Sakura Finetek USA Inc. | 4689 | |
| mouse anti-actin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | JLA20 | Antibody |
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Used in initial RNA purity analysis |
| No. 15 surgical blade | Surgical Design Inc | 17467673 | |
| Odyssey Blocking buffer | LiCor Biosciences | 927-40000 | Western blocking reagent |
| Omni Tissue Master 125 | VWR | 10046-866 | Tissue homogenizer |
| rabbit anti-KCC2 antibody | Cell Signaling Technology | 94725S | Antibody |
| RNA Plus Micro Kit | Qiagen | 73034 | Used to extract RNA from small tissue samples |
| RNaseZap | Life Technologies | AM9780 | |
| Scalpel handle | Excelta Corp. | 16050103 | |
| Standard razor blades | American Line | 66-0362 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596026 | Used to extract RNA from tissue |
Riferimenti
- . Allen Mouse Brain Atlas Available from: https://mouse.brain (2008)
- Kuleshova, E. P. Optogenetics – New Potentials for Electrophysiology. Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).
- Scanziani, M., Häusser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461, 930 (2009).
- Shimono, M., Beggs, J. M. Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome. Cerebral cortex. 25 (10), 3743-3757 (2015).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Kebschull, J. M., et al. High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA. bioRxiv. , 054312 (2016).
- Mitulović, G., Mechtler, K. HPLC techniques for proteomics analysis—a short overview of latest developments. Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).
- Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics. BMC Research Notes. 4, 314 (2011).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. JoVE. (7), e269 (2007).
- Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C., Murran, G. . Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1723, 2457 (2018).
- Björk, K., et al. Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity. The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).
- Jeong, H., et al. Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia. Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).
- Spijker, S., Li, K. W. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics, Neuromethods. 57, 13-26 (2011).
- Palkovits, M. Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat. Brain Research. 59, 449-450 (1973).
- Palkovits, M. . Methods in Enzymology. 103, 368-376 (1983).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. , (2001).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. , (1998).
- RNaseZap. Ambion Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ (2008)
- . RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control Available from: https://www.agilent.com/cs/library/ (2016)
- Scheyer, A. F., et al. Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors. Biological Psychiatry. , (2019).
- Choi, D. W., Rothman, S. M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).
- Guhaniyogi, J., Brewer, G. Regulation of mRNA stability in mammalian cells. Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).
- Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PloS One. 8 (2), 56507 (2013).
- Yamagata, K., et al. Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging. Scientific Reports. 9 (1), 4050 (2019).
- Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute Available from: https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas (2008)
