Her beskriver vi en pålitelig metode for å måle mitokondrie masse og membran potensial i ex vivo kultivert blodkreft stamceller og T-celler.
En fin balanse mellom fredfulle omgivelser, selv-fornyelse, og differensiering er nøkkelen til å bevare blodkreft stilk cellen (HSC) basseng og opprettholde livslang produksjon av alle eldre blodlegemer. I de senere årene cellulære metabolisme har dukket opp som en avgjørende regulator av HSC funksjon og skjebne. Vi har tidligere demonstrert at modulering av mitokondrie metabolisme påvirker HSC skjebne. Spesielt ved kjemisk frakobling av elektron transport kjeden var vi i stand til å opprettholde HSC funksjon i kultur forhold som normalt induserer rask differensiering. Men begrenser HSC tall ofte utelukker bruk av standard analyser for å måle HSC metabolisme og derfor forutsi deres funksjon. Her rapporterer vi en enkel flyt flowcytometri analysen som gir pålitelig måling av mitokondrie membran potensial og mitokondrie masse i knappeceller som HSCs. Vi diskuterer isolering av HSCs fra mus benmarg og måling av mitokondrie masse og membran potensial post ex vivo kultur. Som et eksempel, viser vi modulering av disse parametrene i HSCs via behandling med en metabolsk modulator. Videre utvider vi anvendelsen av denne metodikken på menneskelige perifere blod-avledet T celler og menneskelige tumor infiltrere lymfocytter (TILs), viser dramatiske forskjeller i deres mitokondrie profiler, muligens reflekterer ulike T-celle Funksjonalitet. Vi tror denne analysen kan være ansatt i screenings for å identifisere modulatorer av mitokondrie metabolisme i ulike celletyper i ulike sammenhenger.
Blodkreft stamceller (HSCs) er en liten populasjon av celler som er bosatt i benmargen sikre blod produksjon og homeostase gjennom en organisme liv. HSCs megle denne prosessen ved å gi opphav til forfedre som i sin tur produsere uhelbredelig differensiert modne blodlegemer linjene via flere runder med celledeling og godt orkestrert differensiering trinn1. Viktigere, HSCs produsere sin energi via anaerob Glykolysen. I kontrast, mer engasjerte og aktive blodkreft forfedre slå sine metabolisme mot mitokondrie metabolisme2,3,4. Denne distinkte metabolske tilstanden antas å beskytte HSCs fra cellulære skader påført av reaktive oksygen arter (ros) produsert av aktiv mitokondrier, og dermed opprettholde sin langsiktige in vivo-funksjon5,6,7,8. Direkte måling av HSC metabolske tilstand er utfordrende og ofte lav gjennomstrømning på grunn av deres begrensede tall. Her beskriver vi en Flow flowcytometri-basert analyse for robust måling av mitokondrie membran potensial (ΔΨm) bruker tetramethylrhodamine metyl Ester (TMRM) fluorescens, og mitokondrie massen ved hjelp av en grønn fluorescerende mitokondrie flekken (Mitotracker Green) i HSCs. Vi har tidligere vist at lav ΔΨm er en bona-fide funksjonell markør av høyt renset HSCs9 og metabolske modulatorer i stand til å senke ΔΨm forbedre HSCs funksjon9,10. Her foreslår vi bruk av vår metode på HSCs mitokondrie profilering som strategi for å identifisere romanen molekyler i stand til å forbedre HSCs ‘ langsiktige blod rekonstituering potensial.
Som et eksempel, viser vi at denne analysen pålitelig måler senking av HSC ΔΨm upon eksponering for vitamin B3 analoge nikotinamid riboside (NR). Følgelig, i vår nylig publiserte studien viser vi at NR sterkt ameliorates blod utvinning posttransplant i både mus og humanisert mus systemer ved direkte å forbedre blodkreft stammen og stamfar funksjoner10. Kapasiteten til slike metabolske modulatorer er av stor klinisk verdi med tanke på at en 25% dødsrate er knyttet til forsinkelse i blod og uimottakelig utvinning hos posttransplanted pasienter11,12.
Videre gir vi bevis for at denne metodikken kan anvendes for karakterisering av metabolsk profil og funksjon av menneskelige T-celler. I de senere årene har utviklingen av adoptiv celle terapi (ACT) ved hjelp av autologous tumor infiltrere lymfocytter (TILs) blitt den mest effektive tilnærmingen for visse typer av avansert kreft med ekstremt ugunstig prognose (for eksempel metastatisk melanom, der > 50% av pasientene reagerer på behandling og opptil 24% av pasientene har fullstendig regresjon)13. Men TILs harboring tilstrekkelig antitumor aktivitet er vanskelig å generere14. Den omfattende spredning og stimulering som TILs gjennomgår under ex vivo ekspansjon forårsake T celle utmattelse og senescence som dramatisk svekker T celle antitumor respons15. Viktigere er TILs ‘ antitumoral kapasitet tett knyttet til metabolismen16,17 og tilnærminger som tar sikte på å modulere metabolisme gjennom hemming av PI3K/akt veien har produsert oppmuntrende resultater18,19. Av denne grunn, sammenligner vi ΔΨm av T-celler avledet fra perifere blod mononukleære celler (Pbmc) og pasient-avledet TILs, og viser at mindre differensiert PBMC-avledet T-celler har lavere ΔΨm og mitokondrie masse i forhold til uhelbredelig differensiert TILs.
Vi ser for oss at denne analysen kan brukes til å identifisere romanen metabolske modulatorer som forbedrer HSC og T celle funksjon via modulering av ΔΨm.
En stram regulering av HSC-funksjonen er viktig for å opprettholde stabile hematopoiesen under kroppens levetid. Som ulike andre celletyper i kroppen, en viktig komponent som bidrar til regulering av HSC-funksjonen er cellulær metabolisme. Tidligere studier fra vår Lab9 og andre2,3 har innblandet viktigheten av mitokondrier i å opprettholde en distinkt metabolske tilstand i HSCs. på grunn av det ekstremt lave antallet HSCs isolert fra…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker UNIL Flow flowcytometri Core Facility for deres støtte spesielt Dr. Romain Bedel. Dette arbeidet ble støttet av Kristian Gerhard Jebsen stiftelse stipend til N. V og O.N.
5 mL FACS tubes | Falcon | 352235 | Sample preparation |
96-U bottom plate | Corning | 3799 | Cell culture |
AutoMACS pro separator | Miltenyi Biotec | Automatic Cell separation | |
BD FACS AriaIII | Becton and Dickinson | Cell sorting | |
BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit | BD | 558451 | Lineage depletion |
BD LSRII | Becton and Dickinson | FACS acquisition machine | |
BD-DIVA | Becton and Dickinson | Acquisition software | |
CD150 PE | Biolegend | 115904 | Antibody staining mix |
CD150 PE-Cy5 | Biolegend | 115912 | Antibody staining mix |
CD48 PB | Biolegend | 103418 | Antibody staining mix |
Centrifuge- 5810R | Eppendorf | Centrifugation | |
Ckit PeCy7 | Biolegend | 105814 | Antibody staining mix |
Flow jo | FlowJo LLC | FACS Analysis software | |
GraphPad-Prism | GraphPad | Plotting data into graphs | |
Mitotracker Green | Invitrogen | M7514 | Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM |
Nicotinamide Riboside (NR) | Custom synthesized in house | Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM | |
PBS | CHUV | 1000324 | Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
Pen-Strep (P/S) | Life technologies | 15140122 | Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
RBC Lysis buffer | Biolegend | 420301 | Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x |
Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3) | RnD | 427-FL-005/CF | Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL |
Recombinant mouse stem cell factor (SCF) | RnD | 455-MC-010/CF | Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL |
Sca1 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5981-82 | Antibody staining mix |
StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | SIGMA | S0192 | Ex vivo culture |
Streptavidin Pac orange | Life Technologies | S32365 | Antibody staining mix |
Streptavidin Tx red | Life Technologies | S872 | Antibody staining mix |
TMRM | Invitrogen | T668 | Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM |
Ultra pure EDTA | Invitrogen | 15575-038 | Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM |