Här beskriver vi en tillförlitlig metod för att mäta mitokondriell massa och membran potential i ex vivo odlade hematopoietiska stamceller och T-celler.
En fin balans av quiescence, självförnyelse, och differentiering är nyckeln till att bevara den hematopoietiska stamcells (HSC) pool och upprätthålla livslångt produktion av alla mogna blodkroppar. Under de senaste åren cellulär metabolism har uppstått som en avgörande regulator av HSC funktion och öde. Vi har tidigare visat att modulering av mitokondriell metabolism påverkar HSC ödet. I synnerhet genom att kemiskt avkoppla elektrontransportkedjan kunde vi bibehålla HSC-funktionen i odlingsförhållanden som normalt inducerar en snabb differentiering. Men begränsar HSC-nummer ofta utesluter användning av standardanalyser för att mäta HSC metabolism och därför förutsäga deras funktion. Här rapporterar vi ett enkelt flödescytometri-test som möjliggör tillförlitlig mätning av mitokondriell membranpotential och mitokondriell massa i knappa celler som HSCs. Vi diskuterar isolering av HSCs från mus benmärg och mätning av mitokondriell massa och membran potentiell post ex vivo kultur. Som ett exempel visar vi moduleringen av dessa parametrar i HSCs via behandling med en metabolisk modulator. Dessutom utökar vi tillämpningen av denna metod på mänskliga perifera blod-härledda T-celler och mänsklig tumör infiltrerande lymfocyter (TILs), visar dramatiska skillnader i deras mitokondriella profiler, möjligen återspeglar olika T-cell Funktionalitet. Vi tror att denna analys kan användas i screening för att identifiera modulatorer av mitokondriell metabolism i olika celltyper i olika sammanhang.
Hematopoietiska stamceller (HSCs) är en liten population av celler som är bosatta i benmärgen och säkerställer blod produktion och homeostas under hela organismens livstid. Hscs medla denna process genom att ge upphov till föregångare som i sin tur producerar obotligt differentierade mogna blodkroppar linjer via flera omgångar av celldelning och väl iscensätta differentiering steg1. Viktigare, HSCs producera sin energi via anaerob glykolys. Däremot, mer engagerade och aktiva hematopoietiska stamceller byta sin metabolism mot mitokondriell metabolism2,3,4. Denna distinkta metaboliska tillstånd tros skydda hscs från cellulära skador orsakade av reaktiva syreradikaler (ros) som produceras av aktiva mitokona, och därigenom bibehålla sin långsiktiga in vivo funktion5,6,7,8. Direkt mätning av HSC metaboliska tillstånd är utmanande och ofta låg genomströmning på grund av deras begränsade antal. Här beskriver vi ett flödescytometri-baserat test för robust mätning av mitokondriell membran potential (ΔΨm) med hjälp av tetrametylrodamin metyl Ester (tmrm) fluorescens, och mitokondriell massa med hjälp av en grön fluorescerande mitokondriell fläck (mitotracker grön) i hscs. Vi har tidigare visat att Low ΔΨm är en bona-fide funktionell markör för höggradigt renade hscs9 och metaboliska modulatorer som kan sänka ΔΨm förbättra hscs funktion9,10. Här föreslår vi användning av vår metod på HSCs mitokondriell profilering som strategi för att identifiera nya molekyler som kan förbättra HSCs långsiktiga blodrekonstituering potential.
Som ett exempel visar vi att denna analys på ett tillförlitligt sätt mäter sänkningen av HSC ΔΨm vid exponering för vitamin B3 analog nikotinamid riboside (NR). Följaktligen, i vår nyligen publicerade studie visar vi att nr starkt Ameliorates blod återhämtning transplantation i både mus och humaniserade mus system genom att direkt förbättra hematopoietiska Stem och progenitorfunktioner10. Kapaciteten hos sådana metaboliska modulatorer är av stort kliniskt värde med tanke på att en 25% döds frekvens är kopplad till försening i blod och immun återhämtning hos posttransplanterade patienter11,12.
Dessutom ger vi belägg för att denna metod kan användas för karakterisering av den metaboliska profilen och funktionen hos mänskliga T-celler. Under de senaste åren, utvecklingen av adoptiv cellterapi (ACT) använder autolog tumör infiltrerande lymfocyter (TILs) har blivit den mest effektiva metoden för vissa typer av avancerad cancer med extremt ogynnsamma prognos (t. ex., metastaserande melanom, där > 50% av patienterna svarar på behandling och upp till 24% av patienterna har fullständig regression)13. Men TILs hyser tillräcklig antitumöraktivitet är svåra att generera14. Den omfattande spridning och stimulering som TILs genomgår under ex vivo expansion orsak t cell utmattning och åldras som dramatiskt försämrar t-cell antitumörrespons15. Viktigt, TILs ‘ antitumöreffekt kapacitet är tätt kopplad till deras metabolism16,17 och metoder som syftar till att modulera metabolism genom hämning av PI3K/akt vägen har producerat uppmuntrande resultat18,19. Av denna anledning, vi jämför ΔΨm av T-celler som härrör från perifera blod mononukleära celler (pbmcs) och patient-derived tils, och visar att mindre differentierade PBMC-härledda T-celler har lägre ΔΨm och mitokondriell massa jämfört med obotligt differentierade TILs.
Vi föreställa att denna analys kan användas för att identifiera nya metaboliska modulatorer som förbättrar HSC och T-cells funktion via modulering av ΔΨm.
En stram reglering av HSC-funktion är viktigt att upprätthålla stabila hematopoies under en organism livstid. Liksom olika andra celltyper i kroppen, en viktig komponent som bidrar till regleringen av HSC funktion är cellulär metabolism. Tidigare studier från vår Lab9 och andra2,3 har inblandad betydelsen av mitokonskerna att upprätthålla en distinkt metabolisk tillstånd i hscs. på grund av det extremt låga antalet hscs isolera…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar UNIL Flow Cytometry Core facility för deras stöd särskilt Dr Romain Bedel. Detta arbete stöddes av Kristian Gerhard Jebsen Foundation Grant till N. V och O.N.
5 mL FACS tubes | Falcon | 352235 | Sample preparation |
96-U bottom plate | Corning | 3799 | Cell culture |
AutoMACS pro separator | Miltenyi Biotec | Automatic Cell separation | |
BD FACS AriaIII | Becton and Dickinson | Cell sorting | |
BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit | BD | 558451 | Lineage depletion |
BD LSRII | Becton and Dickinson | FACS acquisition machine | |
BD-DIVA | Becton and Dickinson | Acquisition software | |
CD150 PE | Biolegend | 115904 | Antibody staining mix |
CD150 PE-Cy5 | Biolegend | 115912 | Antibody staining mix |
CD48 PB | Biolegend | 103418 | Antibody staining mix |
Centrifuge- 5810R | Eppendorf | Centrifugation | |
Ckit PeCy7 | Biolegend | 105814 | Antibody staining mix |
Flow jo | FlowJo LLC | FACS Analysis software | |
GraphPad-Prism | GraphPad | Plotting data into graphs | |
Mitotracker Green | Invitrogen | M7514 | Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM |
Nicotinamide Riboside (NR) | Custom synthesized in house | Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM | |
PBS | CHUV | 1000324 | Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
Pen-Strep (P/S) | Life technologies | 15140122 | Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
RBC Lysis buffer | Biolegend | 420301 | Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x |
Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3) | RnD | 427-FL-005/CF | Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL |
Recombinant mouse stem cell factor (SCF) | RnD | 455-MC-010/CF | Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL |
Sca1 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5981-82 | Antibody staining mix |
StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | SIGMA | S0192 | Ex vivo culture |
Streptavidin Pac orange | Life Technologies | S32365 | Antibody staining mix |
Streptavidin Tx red | Life Technologies | S872 | Antibody staining mix |
TMRM | Invitrogen | T668 | Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM |
Ultra pure EDTA | Invitrogen | 15575-038 | Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM |