Hier presenteren we een robuuste en gedetailleerde methode van microtubulus dynamica analyse in cellen gesynchroniseerd in tijdens met behulp van Live-cel spinnen schijf confocale microscopie en MATLAB gebaseerde beeldverwerking.
We beschrijven een modificatie van een gevestigde methode om de dynamiek van microtubulus in levende cellen te bepalen. Het protocol is gebaseerd op de uitdrukking van een genetisch gecodeerde marker voor de positieve uiteinden van microtubuli (EB3 gelabeld met Tdtomaat fluorescerende eiwitten) en hoge-snelheid, hoge-resolutie, Live-celbeeldvorming met behulp van draaiende schijf confocale microscopie. Celcyclus synchronisatie en verhoogde dichtheid van microtubuli worden bereikt door remming van de centrosomale scheiding in mitotische cellen, en analyse van de groei wordt uitgevoerd met behulp van open-source U-track software. Het gebruik van een helder en rood verschoven fluorescerende eiwit, in combinatie met het lagere Laser vermogen en de gereduceerde blootstellingstijd die nodig is voor het spinnen van schijf microscopie verminderen fototoxiciteit en de waarschijnlijkheid van lichtgeïnduceerde artefacten. Dit maakt een groter aantal cellen in dezelfde bereiding mogelijk, terwijl de cellen in een groeimedium onder standaardcultuur omstandigheden worden gehandhaafd. Omdat de analyse wordt uitgevoerd in een automatische gecontroleerde mode, zijn de resultaten statistisch robuust en reproduceerbaar.
Microtubuli (MTs) zijn zeer dynamische structuren gevonden in vrijwel alle eukaryote cellen en in sommige bacteriën1. Samen met actine en tussenliggende filamenten, ze beeldhouwen het cytoskelet2,3. Cell Division4, molecuul transport5, flagellar verslaan6, de sensatie van de omgeving door primaire tril haar cilium7, hoorzitting (kinocilium)8,9, embryo Genesis10,11,12, invasie en metastase13,14, en zelfs Geheugenvorming15,16,17,18, en veel andere processen vertrouwen voornamelijk op MTs. deelname van MTs in al deze gebeurtenissen zou onmogelijk zijn zonder hun opmerkelijke vermogen om snel te schakelen tussen groei (polymerisatie) en krimp (depolymerisatie). Deze eigenschap wordt beschreven als dynamische instabiliteit19. MT dynamiciteit is veranderd in vele pathologische condities20,21,22. Vandaar, het bepalen van de aard van deze eigenschap kan helpen om te begrijpen van de ziekte mechanismen en vervolgens hun behandeling.
Er is een lange lijst met methoden ontwikkeld voor de analyse van MT Dynamics, waarvan de meeste gebaseerd zijn op beeldvormingstechnieken23. Aanvankelijk werden brede veld licht microscopen gebruikt om de vorming van tubuline-polymeren in vitro24te observeren. De ontdekking van end-binding (EB)-eiwitten die verzamelen bij mt plus-ends en de ontwikkeling van methoden tot fluorescently label eiwitten maakten het mogelijk om het gedrag van MTs direct in levende cellen met breed veld en confocale fluorescentie microscopen25,26,27te observeren. Eén EB-eiwit is eind bindende proteïne 3 (EB3)28; door het overdrukken en volgen van EB3 gesmolten tot een fluorescerende proteïne, kunnen MT plus-end assemblage percentages worden bepaald op29,30.
Confocale laser scanning fluorescentiemicroscopie (CLSM) wordt vaak gebruikt om de MT-dynamiek te volgen. Deze beeldvormings techniek vormt echter een hoog risico op fototoxiciteit en fotobleaching, twee ongewenste processen voor de beeldvorming van levende cellen en Dim-voorbeelden31. Om een betere signaal-ruis verhouding te verkrijgen, moeten de laser kracht en de blootstellingsduur hoog genoeg zijn, terwijl ze de monsters niet beschadigen, en dit vereist een opoffering van de resolutie in ruil voor snelheid. Een geschikt alternatief voor CLSM is het spinnen schijf microscopie32. Deze Imaging modaliteit is gebaseerd op het gebruik van een Nipkowschijf33, die bestaat uit een bewegende schijf met een array van pinholes, en werkt op equivalente wijze aan veel CLS microscopen die hetzelfde monster gelijktijdig34. Daarom zal het licht van de laser verschillende gebieden in het monster tegelijkertijd verlichten, maar het confocale karakter behouden. De Nipkowschijf maakt het daarom mogelijk om beelden te verkrijgen die vergelijkbaar zijn met CLSM, maar sneller en minder Laser vermogen gebruiken. De Nipkow-schijf werd verder verbeterd door Yokogawa Electric, die een tweede schijf introduceerde met een reeks micro lenzen erop die individueel direct licht in een respectieve pinhole, verdere vermindering van fototoxiciteit en photobleaching35. Dus, Spinning Disk laser scanning microscopie werd een methode van keuze voor Live Cell Imaging, en het maakt het mogelijk om beelden met een hoge signaal-ruis verhouding te verkrijgen op een hoge snelheid31,36, wat cruciaal is voor het oplossen van signalen zoals die van de snelgroeiende MT-ends.
MT Dynamics verschillen tijdelijk. Bijvoorbeeld, de mitotische MTs zijn dynamischer dan de interfase Ones37,38. Evenzo, verschillen in de groeisnelheid en krimp zijn waargenomen zelfs binnen dezelfde cel cyclus fase, zoals mitose39,40. Daarom, om valse gegevensverzameling te voorkomen, moet de meting van MT Dynamics worden beperkt tot een smal tijdvenster tijdens de celcyclus. Meting van de MT-dynamiek in tijdens kan bijvoorbeeld worden bereikt door de cellen te behandelen met dimethylenastron (DME), een monastrol-analoog dat de motor kinesin Eg541 remt en de vorming van de bipolaire mitotische spindel42verhindert. Remming van cellen bij tijdens met Eg5 remmer DME en andere monastrol derivaten heeft geen invloed op de MT Dynamics43,44,45, waardoor DME een nuttig instrument voor het bestuderen van MT Dynamics zowel in vaste en levende cellen44.
Hier combineren we de methode van MT Dynamics analyse in tijdens cellen, beschreven door ertych et al.44 met Dual Spinning Disk Imaging. Deze methode maakt meting van de MT-dynamiek in prometafase cellen verzameld uit een enkel focal vlak met een hogere Imaging rate, maar zonder photobleaching en minimale fototoxiciteit. Bovendien gebruiken we als fluorescerende reporter tandem dimeer tomaten fluorescerende eiwitten (tdTomato) die de helderheid en foto stabiliteit in vergelijking met het groene fluorescerende eiwit (EGFP) heeft verbeterd en is opgewonden met lager energie licht46. Daarom vereist tdTomato minder Laser vermogen voor excitatie en is het minder fototoxisch. In totaal verbeteren we de methode verder door de fototoxiciteit te verminderen en de resolutie en nabewerking te verbeteren die nodig zijn voor de MT Dynamics-analyse. Bovendien maken we een basis voor toekomstige wijzigingen van de methode door deze te combineren met andere synchronisatie technieken.
Hier beschrijven we een wijziging van een methode die voor het eerst werd vastgesteld door Ertych et al.44. Samen met een aantal andere modificaties, combineren we deze techniek van MT Dynamics analyse met Dual Spinning Disk confocale Imaging. Het gebruik van de Dual Spinning Disk verbetert de resolutie van de groeiende MTs en vermindert fototoxiciteit36. We verminderen verder de fotobleaching en laserlicht veroorzaakte schade van de cellen door over te schakelen naar een l…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken de leden van de lichte microscopie faciliteit, Max-Planck Instituut voor experimentele geneeskunde, voor hun deskundig advies en ondersteuning.
Dimethylenastron | Merck | 324622 | |
DMEM w/o phenol red | Gibco | 31053-28 | |
DPBS | Gibco | 14190-094 | |
Fetal bovine serum | Biochrom | S0415 | |
Fibronectin Bovine Plasma | Merck | F4759 | Sterile powder |
GlutaMAX | Gibco | 35050-038 | Stable glutamine substitutive |
jetPRIME | Polyplus | 114-15 | |
EB3-TdTomato | Addgene | plasmid #50708 | |
RPMI 1640 | Gibco | 61870-010 | |
Trypan Blue | Merck | T8154-20ML | |
Trypsin/EDTA solution | Biochrom | L2143 | 0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium |
µ-slide | Ibidi | 80426 | 4-well slide with #1.5 coverslip |
Eclipse Ti Inverted microscope | Nikon | NA | |
Objective | Nikon | MRD01991 | CFI Apo TIRF 100XC Oil |
ACAL Laser Excahnger | Nikon | Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm | |
Spinning disk module | Andor | CSU-W | |
Camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
Environmental Chamber | Okolab | Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier | |
HeLa Cells | DSMZ | ACC-57 | |
NIS Elements v4 | Nikon | Spinning disk microscope. Acquisition Software | |
MATLAB | Mathworks | Computing environment | |
Prism 8 | GraphPad | Statistical analysis and display software |