Hier stellen wir eine robuste und detaillierte Methode der Mikrotubuli-Dynamikanalyse in Zellen vor, die in der Prometaphase mit Live-Zell-Spinnscheibe konfokaler Mikroskopie und MATLAB-basierter Bildverarbeitung synchronisiert werden.
Wir beschreiben eine Modifikation einer etablierten Methode zur Bestimmung der Mikrotubuli-Dynamik in lebenden Zellen. Das Protokoll basiert auf der Expression eines genetisch kodierten Markers für die positiven Enden von Mikrotubuli (EB3 mit tdTomato fluoreszierendem Protein) und hochgeschwindigkeits-, hochauflösender Live-Zell-Bildgebung mittels konokaler Spinnenvon-Mikroskopie. Die Zellzyklussynchronisierung und die erhöhte Dichte von Mikrotubuli werden durch Hemmung der zentrosomalen Trennung in mitotischen Zellen erreicht, und die Analyse des Wachstums wird mit Open-Source-U-Track-Software durchgeführt. Die Verwendung eines hellen und rot verschiebbaren fluoreszierenden Proteins in Kombination mit der geringeren Laserleistung und der reduzierten Belichtungszeit, die für die Spinnendere benötigt wird, reduziert die Phototoxizität und die Wahrscheinlichkeit lichtinduzierter Artefakte. Dies ermöglicht die Abbildung einer größeren Anzahl von Zellen in der gleichen Zubereitung unter Beibehaltung der Zellen in einem Wachstumsmedium unter Standardkulturbedingungen. Da die Analyse in einer überwachten automatischen Weise durchgeführt wird, sind die Ergebnisse statistisch robust und reproduzierbar.
Mikrotubuli (MTs) sind hochdynamische Strukturen, die in praktisch allen eukaryotischen Zellen und in einigen Bakterien gefunden werden1. Zusammen mit Aktin und Zwischenfilamenten formen sie das Zytoskelett2,3. Zellteilung4, Molekültransport5, Flagellar schlagen6, das Gefühl der Umgebung durch primärecilium7, Hören (Kinocilium)8,9, Embryogenese10,11,12, Invasion und Metastasierung13,14, und sogar Gedächtnisbildung15,16,17,18, und viele andere Prozesse verlassen sich in erster Linie auf MTs. Die Teilnahme von MTs an all diesen Ereignissen wäre ohne ihre bemerkenswerte Fähigkeit, schnell zwischen Wachstum (Polymerisation) und Schrumpfung (Depolymerisation) zu wechseln, nicht möglich. Diese Eigenschaft wird als dynamische Instabilität19beschrieben. MT-Dynamik wird unter vielen pathologischen Bedingungen verändert20,21,22. Daher kann die Bestimmung der Art dieser Eigenschaft helfen, Krankheitsmechanismen und anschließend ihre Behandlung zu verstehen.
Für die MT-Dynamikanalyse wurde eine lange Liste von Methoden entwickelt, von denen die meisten auf bildgebenden Verfahren basieren23. Ursprünglich wurden Weitfeldlichtmikroskope zur Beobachtung der Bildung von Tubulinpolymeren in vitro24eingesetzt. Die Entdeckung von Endbindungsproteinen (EB)-Proteinen, die sich an MT-Plus-Ends sammeln, und die Entwicklung von Methoden zur fluoreszierenden Kennzeichnung von Proteinen ermöglichten es, das Verhalten von MTs direkt in lebenden Zellen mit Weitfeld- und konfokalen Fluoreszenzmikroskopen25,26,27zu beobachten. Ein EB-Protein ist endbindendes Protein 3 (EB3)28; durch Überexpression und Verfolgung von EB3, das zu einem fluoreszierenden Protein verschmolzen wird, können MT-Plus-End-Montageraten bestimmt werden29,30.
Die konfokale Laserscanning-Fluoreszenzmikroskopie (CLSM) wird häufig verwendet, um der MT-Dynamik zu folgen. Diese bildgebende Technik stellt jedoch ein hohes Risiko für Phototoxizität und Photobleaching, zwei unerwünschte Prozesse für lebende Zellen und dim Probenbildgebung31. Um ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen, sollten die Laserleistung und die Belichtungsdauer hoch genug sein, ohne die Proben zu beschädigen, und dies erfordert eine Aufblätung der Auflösung im Austausch für Geschwindigkeit. Eine geeignete Alternative zu CLSM ist die Spinnscheibenmikroskopie32. Diese bildgebende Modalität basiert auf der Verwendung einer Nipkow-Scheibe33, die aus einer beweglichen Scheibe besteht, die eine Reihe von Lochlöchern trägt, und arbeitet äquivalent zu vielen CLS-Mikroskopen, die die gleiche Probe gleichzeitig darstellen34. Daher leuchtet das Licht des Lasers mehrere Bereiche in der Probe gleichzeitig, behält aber die konfokale Natur bei. Die Nipkow-Festplatte ermöglicht es daher, Bilder zu erhalten, die CLSM ähneln, aber schneller und mit weniger Laserleistung. Die Nipkow-Scheibe wurde von Yokogawa Electric weiter verbessert, die eine zweite Scheibe mit einer Reihe von Mikrolinsen auf sie einführte, die einzeln Licht in ein entsprechendes Loch leiten, wodurch Phototoxizität und Photobleichung weiter reduziert werden35. So wurde die Spinnscheiben-Laserscanmikroskopie zu einer Methode der Wahl für die Live-Zell-Bildgebung, und es ermöglicht, Bilder mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis bei einer hohen Geschwindigkeitvon 31,36zu erhalten, was für das Auflösen von Signalen wie denen von den schnell wachsenden MT-Enden entscheidend ist.
Mt-Dynamik unterscheidet sich vorübergehend. Beispielsweise sind die mitotischen MTs dynamischer als die Interphase-MTs37,38. In ähnlicher Weise wurden Unterschiede in der Wachstumsrate und Schrumpfung sogar innerhalb derselben Zellzyklusphase beobachtet, wie Mitose39,40. Um eine falsche Datenerfassung zu vermeiden, sollte die Messung der MT-Dynamik daher während des Zellzyklus auf ein enges Zeitfenster beschränkt werden. Zum Beispiel kann die Messung der MT-Dynamik in der Prometaphase durch die Behandlung der Zellen mit Dimethylenastron (DME) erreicht werden, einem monastrolen Analogon, das die Motorkinus eg541 hemmt und die Bildung der bipolaren Mitotischen Spindel42verhindert. Die Hemmung von Zellen in der Prometaphase mit Eg5-Hemmer DME und anderen monastrolen Derivaten hat keinen Einfluss auf die MT-Dynamik43,44,45, was DME zu einem nützlichen Werkzeug für die Untersuchung der MT-Dynamik sowohl in festen als auch in lebenden Zellen macht44.
Hier kombinieren wir die von Ertych etal. 44 beschriebene Methode der MT-Dynamikanalyse in Prometaphasenzellen mit dualspinnierender Scheibenbildgebung. Diese Methode ermöglicht die Messung der MT-Dynamik in Prometaphasenzellen, die von einer einzigen Fokalebene mit einer höheren Bildrate, jedoch ohne Photobleichung und minimale Phototoxizität gesammelt wurden. Darüber hinaus verwenden wir als fluoreszierender Reporter Tandem-Dimer Tomato fluorescent protein (tdTomato), das die Helligkeit und Photostabilität im Vergleich zum grünen Fluoreszenzprotein (EGFP) verbessert hat und mit weniger Energielicht46angeregt wird. Daher benötigt tdTomato weniger Laserleistung für die Anregung und ist weniger fototoxisch. Insgesamt verbessern wir die Methode weiter, indem wir die Phototoxizität reduzieren und die Auflösung und Nachbearbeitung verbessern, die für die MT-Dynamikanalyse erforderlich sind. Darüber hinaus schaffen wir eine Grundlage für zukünftige Änderungen der Methode, indem wir sie mit anderen Synchronisationstechniken kombinieren.
Hier beschreiben wir eine Modifikation einer Methode, die zuerst von Ertych et al.44etabliert wurde. Zusammen mit einigen anderen Modifikationen kombinieren wir diese Technik der MT-Dynamikanalyse mit der konfokalen Bildgebung der Doppelspinnscheibe. Die Verwendung der Doppelspinnscheibe verbessert die Auflösung wachsender MTs und reduziert gleichzeitig die Phototoxizität36. Wir reduzieren die Photobleaching- und Laserlichtschäden der Zellen weiter, indem wir zu einem fl…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken den Mitgliedern der Lichtmikroskopieanlage, dem Max-Planck-Institut für Experimentelle Medizin, für die fachkundige Beratung und Unterstützung.
Dimethylenastron | Merck | 324622 | |
DMEM w/o phenol red | Gibco | 31053-28 | |
DPBS | Gibco | 14190-094 | |
Fetal bovine serum | Biochrom | S0415 | |
Fibronectin Bovine Plasma | Merck | F4759 | Sterile powder |
GlutaMAX | Gibco | 35050-038 | Stable glutamine substitutive |
jetPRIME | Polyplus | 114-15 | |
EB3-TdTomato | Addgene | plasmid #50708 | |
RPMI 1640 | Gibco | 61870-010 | |
Trypan Blue | Merck | T8154-20ML | |
Trypsin/EDTA solution | Biochrom | L2143 | 0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium |
µ-slide | Ibidi | 80426 | 4-well slide with #1.5 coverslip |
Eclipse Ti Inverted microscope | Nikon | NA | |
Objective | Nikon | MRD01991 | CFI Apo TIRF 100XC Oil |
ACAL Laser Excahnger | Nikon | Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm | |
Spinning disk module | Andor | CSU-W | |
Camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
Environmental Chamber | Okolab | Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier | |
HeLa Cells | DSMZ | ACC-57 | |
NIS Elements v4 | Nikon | Spinning disk microscope. Acquisition Software | |
MATLAB | Mathworks | Computing environment | |
Prism 8 | GraphPad | Statistical analysis and display software |