클리어 심장 3 차원 이미징을 통해 표적 세포 집단의 심장 손상 반응을 캡처

Summary

상해 다음 심근 세포 증식은 비 근세포 세포 집단에서 세포 외 단서의 교향곡을 요구하는 동적 프로세스입니다. 계보 추적, 수동 선명도 및 3차원 전체 마운트 공초점 현미경 기술을 활용하여 다양한 세포 유형이 심장 수리 및 재생에 미치는 영향을 분석할 수 있습니다.

Abstract

심혈관 질환은 다른 모든 사망 원인을 능가하며 전 세계적으로 사망률의 31%를 차지합니다. 이 질병은 주로 급성 심근 경색의 형태로 심장 손상으로 나타납니다. 부상 다음 약간의 탄력성으로, 한 번 건강한 심장 조직은 섬유질로 대체됩니다, 비 수축 흉터 조직종종 심장 마비의 전주곡이 될. 재생 의학에서 새로운 치료 옵션을 식별 하기 위해, 연구는 타고난 재생 기능을 가진 척추 동물에 초점을 맞추고 있다. 그러한 모델 유기체 중 하나는 강력한 심근 재생으로 심장 손상에 반응하는 신생아 마우스입니다. 임상적으로 관련이 있는 신생아 마우스의 부상을 유도하기 위해, 우리는 인간의 심장에 있는 동맥 경화증에 의해 유발된 심근 경색을 미러링하는 왼쪽 전방 내림차순 동맥 (LAD)을 폐색하는 수술을 개발했습니다. 심근세포 와 비 근세포 집단 내의 변화를 추적하는 기술과 일치할 때, 이 모형은 심혼 재생을 인도하는 기계장치를 확인하는 플랫폼을 저희에게 제공합니다. 상해 다음 심장 세포 인구에 있는 변경에 통찰력을 얻는 것은 한 번 2 차원 분석으로 제한되고 수시로 프로세스에 있는 조직을 손상하는 조직 단면도 와 조직학 검사와 같은 방법에 크게 의존했습니다. 더욱이, 이 방법은 세포 계의 변경을 추적하는 기능이 부족합니다, 대신 상해 반응의 단지 스냅샷을 제공하. 여기에서는 계보 추적 모델, 전체 장기 클리어링 및 3차원(3D) 전체 마운트 현미경 검사법에서 기술적으로 진보된 방법을 사용하여 심장 수리 메커니즘을 설명하는 방법을 설명합니다. 신생아 마우스 심근 경색 수술, 조직 정리 및 3D 전체 장기 이미징을위한 프로토콜을 사용하면 심근 세포 증식을 유도하는 복잡한 경로를 풀어 심장 재생을위한 새로운 치료 목표를 드러냅니다.

Introduction

심혼은 오래 포스트 유사분열 기관으로 여겨지고 있습니다, 그러나 최근 기록은 심근 세포 갱신이 대략 1%에 성인 인간 심혼에서 일어납니다^1. 그러나, 심근 세포 회전율의 이 낮은 비율은 상해 다음 생기는 조직의 거대한 손실을 보충하기 위하여 불충분합니다. 심근 경색을 겪은 심장은 심근세포 약 10억 개를 잃게 되며, 종종 심부전과 갑작스런 심장 사망의 전주곡으로 쓰일 수 있습니다^2,,3. 전 세계적으로 2,600만 명 이 넘는 사람들이 심장 마비로 인해 심장 질환으로 인한 피해를 되돌릴 수있는 치료법에 대한 충족되지 않은^{필요성이 있습니다 4.}

치료에 있는 이 격차를 해소하기 위하여는, 과학자는 상해 다음 내인성 재생의 기초가 되는 진화적으로 보존한 기계장치를 조사하기 시작했습니다. 포유류 심장 재생을 연구하기위한 하나의 모델은 신생아 마우스입니다. 출생 다음 주 안에, 신생아 마우스는 심장 손상 다음 강력한 재생 반응이^5. 우리는 이전에 신생아 마우스가 정점 절제술⁵에 따라 심근 세포 증식을 통해 심장을 재생할 수 있음을 입증했습니다. 이 기술은 신생아에서 심장 재생을 불러 일으킬 수 있지만, 수술은 인간의 심장 부상에 임상 관련성이 부족합니다. 신생아 마우스 모델에서 사람의 상해를 모방하기 위해 관상동맥 폐색을 통해 심근경색을 유도하는 기술을^{개발하도6.} 이 기술은 좌심실 심근 에 혈액의 40%-50%를 전달하는 책임있는 좌측 전방 내림차종 동맥 (LAD)의 외과^{결찰을 요구합니다 6,,7.} 따라서, 수술은 좌심실 벽의 상당 부분에 영향을 미치는 경색을 초래한다. 심근에 이 손상은 신생아에 있는 심근 세포 증식 그리고 심혼 재생을 자극할 것입니다^5.

관상 동맥 폐색 수술은 심장 재생의 내부 작용을 밝히기 위해 매우 재현가능하고 직접적인 번역 방법을 제공합니다. 신생아 수술은 인간의 심장에 관상 동맥 동맥 경화증을 평행, 여기서 동맥의 내벽 내에서 플라크의 축적은 폐색 및 후속 심근 경색을 일으킬 수 있습니다^8. 심부전 환자를 위한 치료 치료에 있는 무효 때문에, LAD에 있는 폐색은 상해⁹다음 년 안에 26%까지 도달하는 사망률과 연관되고, 결과적으로 “과부 제조자”로 불려졌습니다. 치료법의 발전은 심장 손상의 복잡한 생리적 및 병리학적 효과를 정확하게 반영하는 모델이 필요합니다. 신생아 마우스 심장 부상에 대한 우리의 수술 프로토콜은 연구원이 부상 후 포유류 심장 재생을 신호 분자 및 세포 단서를 조사 할 수있는 플랫폼을 제공합니다.

최근 연구는 세포 외 환경과 증식 심근 세포 사이의 동적 관계를 강조합니다. 예를 들어, 산후 재생 창은^{심장(10)을}둘러싼 세포외 기질의 강성을 감소시킴으로써 연장될 수 있다. 신생아 외 세포 질성에서 생체 물질은 또한 심장 부상 다음 성인 포유류 심장에서 심장 재생을 촉진 할 수^{있습니다 11.} 또한 수반되는 심근세포 증식은 혈관신생 반응^12,,13; 신생아 마우스의 재생심장에 특이적인 부수적인 동맥 형성은 심장 재생을 자극하는 데 필수적인 것으로 나타났다^12. 더욱이, 우리의 실험실은 신경 신호가 성장 인자 수준의 변조를 통해 심근 세포 증식 및 심장 재생을 조절하고, 부상 다음 염증^반응14를입증했다. 이 사실 인정은 심장 상해에 응하여 비 근세포 세포 인구를 추적하는 필요를 강조합니다. 이 목표를 달성하기 위해, 우리는 계보 추적을 위한 형광 리포터 단백질의 구성또는 조건부 표현을 통합하기 위하여 형질전환 마우스 라인에 있는 Cre-lox 재조합 시스템을 이용했습니다. 더욱이, 우리는 표적 세포^{집단(15)의}클론 팽창을 결정하기 위해 Cre 의존성, 다색 형광기의 스토컨스 발현에 의존하는 레인보우 마우스 라인으로 클론 팽창 패터닝을 결정하기 위한 고급 방법을 사용할 수 있다. 신생아 관상 동맥 폐색 수술과 계보 추적을 채택하는 것은 심장 재생의 복잡한 세포 메커니즘을 해부하기위한 강력한 도구입니다.

3차원(3D) 전체 장기 이미징으로 형광표지된 세포의 혈통을 추적하는 것은 전통적인 단면화 및 재건 기법을 사용하여 달성하기 가 어렵습니다 – 특히 신경 섬유 나 혈관과 같은 세포 집단이 취약할 때. 광학 단면에 의하여 기관의 직접적인 전체 마운트 화상 진찰이 표면 적인 세포 인구를 붙잡을 수 있는 동안, 조직 내의 깊은 곳에 있는 구조물은 접근할 수 없는 남아 있습니다. 이러한 장벽을 우회하기 위해 전체 장기 조직의 불투명도를 줄이기 위해 조직 정리 기술이 개발되었습니다. 최근에는 지질^추출을통해 고정조직을 클리어하는 클리어 지질교환 아크릴아미드-혼성화 강성 이미징 호환 조직 hYdrogel(CLARITY)-기반 방법(CLARITY)에 상당한 진전이 이루어지고 있다. 단계는 또한 굴절률을 균질화하고 이후에 화상 진찰¹⁷동안 광 산란을 감소시키기 위하여 취합니다. 이러한 방법 중 하나는 활성 CLARITY이며, 이는 전기 활성을 이용하여 조직 전체에 세제를 침투시킴으로써 지질 분해를^{가속화한다(18).} 효과적이지만, 이 조직 정리 방법은 고가의 장비를 필요로 하고 조직 손상을 일으킬 수 있으며, 심장^{신경(19)과}같은 연약한 세포 집단과 호환되지 않는 접근법을 만드는 것이다. 따라서, 우리는 부드럽게 세제 침투를 용이하게하기 위해 열에 의존 수동 CLARITY 접근 방식을 채택, 따라서 복잡한 세포 구조의 보존에 도움^20,,21.

수동 선명도는 일반적으로 활성 CLARITY 보다 덜 효율적인 것으로 생각^{된다 18,}기술은 종종 두 가지 주요 장애물을 동반: 전체 장기 깊이 지우지 못하는 성인 조직을 취소 하는 데 필요한 시간의 광범위 한 금액. 우리의 수동적인 CLARITY 접근법은 신생아와 성인 심장 조직을 완전히 지를 수 있는 신속한 클리어링 프로세스로 이러한 장벽을 모두 극복합니다. 우리의 수동 CLARITY 조직 정리 기술은 성인 심혼을 통하여 분포된 희소한 인구를 포함하여 심장 세포 인구의 다양한 의 시각화를 허용하는 효율성에 도달했습니다. 지워진 심혼이 공초점 현미경으로 심상될 때, 발달, 질병 및 재생 도중 세포 특정 패터닝의 건축은 점등될 수 있습니다.

Protocol

모든 실험은 실험실 동물의 사용 및 관리를위한 가이드에 따라 위스콘신 – 매디슨 대학의 의학 및 공중 보건 학교의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 따라 수행되었습니다. 모든 방법은 잭슨 연구소에서 얻은 야생 형 C57BL / 6J (B6) 및 형질전환 마우스 라인에서 수행되었다. 1. 관상 동맥 폐색 (심근 경색) 1 일 된 신생아 마우스에서 왼쪽 전방 내림차순 동맥 (LAD)의 결찰을 통해 유?…

Representative Results

종종 가장 어려운 두 단계는 가슴 구멍에서 심장을 안내하고 LAD를 결찰하는 것입니다. 이러한 단계를 해결하기 위해, 조정은 제 4 늑간 근육 사이의 초기 펑크의 배치에 이루어질 수있다; 천자와 무딘 해부가 흉골에 너무 가깝으면 심장이 흉강을 빠져 나갈 수 없을 수 있습니다(그림 1A). 추가적으로, 좌측 복부에 증가한 압력은 이 프로세스를…

Discussion

심근세포와 비 근세포 집단 사이의 세포 세포 상호 작용은 심장이 섬유증을 겪거나 부상 다음 수리를 받을지 여부를 결정하는 요소입니다. 발견은 신경^14,후막 세포^24,복막 대식세포^25,동맥^12,,13,및 림프내피^{세포(26)를}포함한 다양한 세포 유형이 모두 심장 수리를 중재하는 데 필수적…

Materials

1-thioglycerol
6-0 Prolene Sutures	Ethicon	8889H	Polypropylene Sutures
Acrylamide
Boric acid
Curved Forceps	Excelta	16-050-146	Half Curved, Serrated, 4 in
Dressing Forceps	Fisherbrand	13-812-39	Dissecting, 4.5 in
Glass Vial	Fisherbrand	03-339-26A	12 x 35 mm Vial with Cap
Histodenz	Sigma-Aldrich		Density gradient medium
Iridectomy Scissors	Fine Science Tools	15000-03	2 mm Cutting Edge
Large Dissecting Scissors	Fisherbrand	08-951-20	Straight, 6 in
Needle Holder	Fisherbrand	08-966	Mayo-Hegar, 6 in
Paraformaldehyde
Phosphate Buffer
Sharp Forceps	Sigma-Adrich	Z168777	Fine Tip, Straight, 4.25 in
Small Dissecting Scissor	Walter Stern Inc	25870-002	30 mm Cutting Edge
Sodium Azide
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)
Tissue Forceps	Excelta	16050133	Medium Tissue, 1X2 Teeth
VA-044	Wako Chemicals		Water-soluble azo initiator