通过清除心脏三维成像捕获目标细胞群的心脏损伤反应

Summary

伤愈后心肌细胞增殖是一个动态过程，需要来自非肌细胞群的细胞外线索交响。利用谱系跟踪、被动CLARITY和三维全贴装共聚焦显微镜技术，可以分析各种细胞类型对心脏修复和再生的影响。

Abstract

心血管疾病比所有其他死亡原因都多，是全世界31%的死亡原因。这种疾病表现为心脏损伤，主要是急性心肌梗死。受伤后恢复力小，曾经健康的心脏组织将被纤维化、非收缩性疤痕组织所取代，并且经常是心力衰竭的前奏。为了确定再生医学中新的治疗方案，研究的重点是具有先天再生能力的脊椎动物。新生儿小鼠是一种模型有机体，它通过强健的心肌再生对心脏损伤做出反应。为了引起新生儿小鼠的损伤，临床上相关，我们开发了一种手术，以遮挡左前部下部动脉（LAD），反映由人的心脏动脉粥样硬化引起的心肌梗死。当与跟踪心肌细胞和非肌细胞群内变化的技术相匹配时，该模型为我们提供了一个平台，用于识别指导心脏再生的机制。深入了解受伤后心脏细胞群的变化，曾经严重依赖组织切片和组织学检查等方法，这些方法仅限于二维分析，在此过程中经常损害组织。此外，这些方法缺乏跟踪细胞谱系变化的能力，而只是提供损伤反应的快照。在这里，我们描述了如何在谱系跟踪模型、整个器官清理和三维（3D）全安装显微镜中采用先进的技术方法来阐明心脏修复的机制。通过新生儿小鼠心肌梗死手术、组织清理和3D全器官成像方案，可以解开诱导心肌细胞增殖的复杂途径，揭示心脏再生的新治疗靶点。

Introduction

心脏长期以来一直被认为是一个后心肌器官，但最近的证据表明，心肌细胞更新发生在成人心脏约1%每年^1。然而，这些低的心肌细胞周转率不足以补充受伤后发生的组织大量损失。一颗患有心肌梗死的心脏会失去大约10亿心肌细胞，通常作为心力衰竭和心脏突然死亡的前奏^。,3全世界有超过2600万人受心力衰竭影响，因此对治疗治疗的需求得不到满足，这种疗法可以扭转心脏病^{造成的伤害。}

为了弥补治疗学的这一差距，科学家们已经开始研究在损伤后内源性再生的基础进化保护机制。研究哺乳动物心脏再生的一个模型是新生儿小鼠。在出生后的一周内，新生儿小鼠在心脏损伤⁵后有强大的再生反应。我们先前已经证明，新生儿小鼠可以通过心肌细胞增殖再生心脏后，一个呼吸节^5。虽然这种技术可以唤起新生儿的心脏再生，手术缺乏临床相关性的人的心脏损伤。为了模仿新生儿小鼠模型中的人体损伤，我们开发了一种通过冠状^{动脉阻塞6}诱导心肌梗死的技术。这项技术需要左前下部动脉（LAD）的手术结扎，负责将40%-50%的血液输送到左心室心肌^66，7。7因此，手术导致一个梗塞，影响左心室壁的很大一部分。这种对心肌损伤将刺激新生儿心肌细胞增殖和心脏再生^5。

冠状动脉闭塞手术提供了一种高度可重复和直接的转化方法，可以揭示心脏再生的内部工作。新生儿手术平行于人心脏冠状动脉粥样硬化，动脉内壁内斑块的积累可引起阻塞和随后的心肌梗死^8。由于心力衰竭患者的治疗无效，LAD的封闭与9^人受伤后一年内死亡率高达26%相关，因此被称为”寡妇制造者”。治疗的进步需要一个模型，准确地反映心脏损伤的复杂生理和病理影响。我们的新生儿小鼠心脏损伤手术方案提供了一个平台，使研究人员能够研究在受伤后向哺乳动物心脏再生发出信号的分子和细胞线索。

最近的研究强调了细胞外环境和增殖心肌细胞之间的动态关系。例如，产后再生窗口可以通过降低心脏周围细胞外基质的刚度^来延长。新生儿细胞外基质的生物材料也可促进心脏损伤后成年哺乳动物心脏的心脏再生^。伴随心肌细胞增殖的还有血管生成反应^12，13;12,新生儿小鼠再生心脏特有的动脉形成证明对刺激心脏再生^至关重要。此外，我们的实验室已经证明，神经信号通过调节生长因子水平，以及损伤后炎症反应调节心肌细胞增殖和心脏再生^14。这些发现强调需要追踪非肌细胞群，以回应心脏损伤。为了实现这一目标，我们利用了转基因小鼠系的Cre-lox重组系统，将荧光报告蛋白的组成或条件表达纳入系系追踪。此外，我们可以使用先进的方法确定与彩虹小鼠线的克隆扩张模式，它依赖于对克里依赖的、多色荧光机的随机表达来确定靶细胞群¹⁵的克隆扩张。使用新生儿冠状动脉闭塞手术进行系系追踪是剖析心脏再生复杂细胞机制的有力工具。

使用传统的切片和重建技术，很难使用三维（3D）全器官成像来跟踪荧光标记细胞的血统，尤其是在细胞群脆弱时，如神经纤维或血管。虽然通过光学切片直接全装成像器官可以捕获表面细胞群，但位于组织深处的结构仍然无法进入。为了避开这些障碍，已经开发出组织清除技术，以减少整个器官组织的不全性。最近，在透明脂质交换丙烯酰胺杂交硬成像兼容组织hYdrogel（CLARITY）-为基础的方法，通过脂质提取¹⁶清除固定组织取得了重大进展。还采取措施使折射率均质化，并在成像¹⁷时减少光散射。其中一种方法是活性CLARITY，它通过使用电泳来穿透整个组织¹⁸的洗涤剂来加速脂质分解。虽然有效，这种组织清除方法需要昂贵的设备，并可能导致组织损伤，使这种方法与脆弱的细胞群，如心脏神经¹⁹不相容。因此，我们采用被动的CLARITY方法，依靠热量轻轻促进洗涤剂的渗透，从而有助于保留复杂的细胞结构^{20，21。20,}

被动CLARITY通常被认为不如主动CLARITY¹⁸有效，因为该技术通常伴随着两个主要障碍：无法清除整个器官深度和清除成人组织所需的大量时间。我们的被动 CLARITY 方法通过加速清除过程克服了这两个障碍，能够完全清除新生儿和成人心脏组织。我们的被动 CLARITY 组织清除技术已达到一种效率，能够可视化各种心脏细胞群，包括分布在成人心脏的罕见人群。当用共聚焦显微镜成像清除的心脏时，可以在发育、疾病和再生期间照亮细胞特异性模式的架构。

Protocol

所有实验均按照《实验室动物使用和护理指南》进行，并符合威斯康星大学麦迪逊分校医学和公共卫生学院的机构动物护理和使用委员会。所有方法均对从杰克逊实验室获得的野生C57BL/6J（B6）和转基因小鼠线执行。 1. 冠状动脉阻塞（心肌梗死）通过左前体下降动脉（LAD）在1天大新生儿小鼠6的结扎诱导 将1天大的新生儿与母崽分开，将它们与一些原?…

Representative Results

通常，两个最具挑战性的步骤是引导心脏走出胸腔和将LAD与LAD连体。为了排除这些步骤的故障，可以调整第四节间肌肉之间的初始穿刺的位置;如果穿刺和钝剖面离胸骨太近，心脏可能无法退出胸腔（图1A）。 此外，可能需要增加左腹部的压力，以促进这一过程（图1B）。当心脏放在隔节间肌肉上时，也可?…

Discussion

心肌细胞和非肌细胞群之间的细胞相互作用是心脏在受伤后是否会经历纤维化或修复的决定性因素。发现表明，各种细胞类型，包括神经^14，表皮细胞^24，围毛体巨噬细胞^25，动脉12，13，和淋巴内皮^12,13细胞^26，都发挥着重要的调解心脏修复。通过在小鼠身上应用Cre-lox和CRISPR-Cas9技术…

Materials

1-thioglycerol
6-0 Prolene Sutures	Ethicon	8889H	Polypropylene Sutures
Acrylamide
Boric acid
Curved Forceps	Excelta	16-050-146	Half Curved, Serrated, 4 in
Dressing Forceps	Fisherbrand	13-812-39	Dissecting, 4.5 in
Glass Vial	Fisherbrand	03-339-26A	12 x 35 mm Vial with Cap
Histodenz	Sigma-Aldrich		Density gradient medium
Iridectomy Scissors	Fine Science Tools	15000-03	2 mm Cutting Edge
Large Dissecting Scissors	Fisherbrand	08-951-20	Straight, 6 in
Needle Holder	Fisherbrand	08-966	Mayo-Hegar, 6 in
Paraformaldehyde
Phosphate Buffer
Sharp Forceps	Sigma-Adrich	Z168777	Fine Tip, Straight, 4.25 in
Small Dissecting Scissor	Walter Stern Inc	25870-002	30 mm Cutting Edge
Sodium Azide
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)
Tissue Forceps	Excelta	16050133	Medium Tissue, 1X2 Teeth
VA-044	Wako Chemicals		Water-soluble azo initiator