Isolering och kultur av mänskliga mogna adipocyter med membran mogna Adipocyte aggregerade kulturer (MAAC)

Summary

Membran mogna adipocyte aggregerad kultur (MAAC) är en ny metod för att kultur mogna mänskliga adipocyter. Här beskriver vi hur man isolerar adipocyter från mänsklig adipose och hur man ställer in MAAC.

Abstract

Vit fettvävnad (WAT) dysregulation spelar en central roll i utvecklingen av insulinresistens och typ 2-diabetes (T2D). För att utveckla nya behandlingar för T2D krävs mer fysiologiskt relevanta in vitro adipocyte-modeller. Denna studie beskriver en ny teknik för att isolera och kultur mogna mänskliga adipocyter. Denna metod har rätt MAAC (membran mogen adipocyte aggregerad kultur), och jämfört med andra adipocyte in vitro modeller, maac har en adipogenic gen signatur som är närmast nyligen isolerade mogna adipocyter. Med hjälp av MAAC kan adipocyter odlas från magra och feta patienter, olika fettdepåer, samodlade med olika celltyper, och viktigast av allt, kan hållas i kultur i 2 veckor. Funktionella experiment kan också utföras på MAAC inklusive glukos upptag, lipogenesis, och lipolys. Dessutom svarar MAAC robust på olika farmakologiska agonism och kan användas för att studera adipocyte fenotypiska förändringar, inklusive transdifferentiering av vita adipocyter till brun-liknande fettceller.

Introduction

Den globala ökningen av fetma och fetma-relaterade samsjuklighet kräver utveckling av nya therapeutics. Vit fettvävnad (WAT) är en viktig regulator av hela kroppenmetabolism, energi homeostas, och är en central aktör i utvecklingen av insulinresistens och typ 2-diabetes (T2D)^1,2. Under kronisk överskott kaloriförbrukning, adipocyter förstora för att hantera överskott av energi. Emellertid, adipocyte lipid lagringskapacitet kan bli överskriden, vilket resulterar i en höjd av cirkulerande nivåer av fettsyror och ökad lagring i perifera icke-fettvävnad och leder till lipotoxicitet^3,4.

Bristen på adipocyte in vitro modeller med hög translationell relevans är en viktig utmaning i utvecklingen av nya behandlingar för fetma och T2D. Ex vivo explant modell, där små bitar av fettvävnad odlas, är associerad med snabba förändringar i adipogenic gen uttryck drivs av hypoxi och inflammation^5,6. Takkulturer (CCs) där mogna adipocyter flyter och håller sig till toppen av mediefyllda kolvar, snabbt dedifferentiate i fibroblast-liknande celler saknar lipid^7,8,9,10. Den vanligaste modellen är adipocyter differentierade in vitro från engagerade prekursorer. De differentierade cellerna är dock morfologiskt åtskilda från mogna adipocyter in vivo eftersom de är mycket mindre i storlek och saknar en unilocular lipid dropp. Andra begränsningar med denna modell inkluderar det ofysiologiska behovet av en kemisk cocktail för att driva differentiering, samt variationer i differentiering effektivitet som kan påverkas av ett antal faktorer^11,12,13,14.

Vi har nyligen utvecklat membran mogna adipocyte samlad kultur (MAAC), en metod för långsiktig kultur av nyisolerade mogna adipocyter, där adipocyter odlas under genomsläppliga membran¹⁰. Opartisk analys av RNA sekvenseringdata har visat att i förhållande till fettvävnadsväxter och in vitro-differentierade adipocyter är MAAC mest lik nyisolerade adipocyter. MAAC kan användas för att odla mogna adipocyter isolerade från både subkutan och visceral fettvävnad, samt adipocyter från både feta och magra ämnen. Denna metod tillåter studiet av långsiktiga adipocyte fenotypiska förändringar och underlättar samodling av adipocyter med andra celltyper. Här ger vi ett detaljerat protokoll för isolering av mogna adipocyter från mänsklig fettvävnad och hur man ställer in MAAC-systemet.

   

Protocol

Anonyma prover av fettvävnad samlades in från bukregionen av kvinnliga patienter som genomgår elektiv kirurgi vid Sahlgrenska universitetssjukhuset i Göteborg. Alla försökspersoner fick skriftlig och muntlig information innan de gav skriftligt informerat samtycke för användning av vävnaden. Studierna godkändes av Regionetisk prövningsnämnd i Göteborg. EN ÖVERSIKT ÖVER metoden finns i figur 1. 1. Beredning av buffertar, vävnadskultur media och kulturplattor Förbered en 5x Krebbs Ringer (KR) lager genom upplösning 35,1 g NaCl, 1,75 g KCl, 0,82 g KH2PO4, och 1,48 g MgSO4·7H2O i 900 ml vatten. Tillsätt 1,84 g CaCl2·2H2O och justera volymen till 1 L genom att tillsätta vatten. Sterilt filter genom ett 0,22 μm filter och förvaras vid 4 °C. Från 5x KR-lagret, förbereda 1 L buffert som innehåller 1x kr, 25 mM HEPES, 2 mM glukos och 2% bovin serum albumin (BSA) (nedan kallad tvättbuffert). Justera pH till 7,4. Förbered 500 ml kollagenbuffert som innehåller 1x HBSS + CaCl2 + MgCl2, 2% BSA och 450 ml vatten (kallas matsmältningsbuffert).OBS: Kollagen bör inte läggas till matsmältningsbufferten förrän efter fettvävnaden har vägts i steg 2.2. Justera pH-värdet på Medel 199 till 7,4. Sterilt filtrera både buffertar och medium 199 genom en 0,22 μm filterkolv och värm till 37 °C.OBS: För att spara tid, vävnadskultur media kan förberedas och läggas till plattor innan bearbetning av fettvävnad. För en 24-brunn tallrik format(figur 1A), använd 0,5−1 ml/well av Dulbecco modifierade Eagle’s medium / Hams näringsblandning F12 (DMEM/F12), 10% fetala nötkreatur serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin (penn / strep) och 20 nM insulin. Små molekyler och andra stabila farmakologiska medel kan också läggas till vid denna tid till media i önskad layout. Placera plattorna i en vävnadskulturinkubator (37 °C, 5% CO2). 2. Dissekering av human subkutan fettvävnad OBS: Arbeta inom ett biologiskt säkerhetsskåp och använd steril teknik under hela isoleringsprocessen, samt exklusiv användning av autoklaverad och steril utrustning. Placera den mänskliga fettvävnaden i en 15 cm petriskål och tillsätt en liten volym medium 199 för att hålla den återfuktad under dissekering. Arbeta med bitar av fett ungefär lika stor som en golfboll, ta tag i stora fibrotiska kärl med pincett och försiktigt släppa adipocyter genom att skrapa fettet med baksidan av slutna saxar. Kasta de stora bitar av fibrotisk vävnad. Väg det trimmade fettet. 3. Kollagen Behandling Tillsätt kollagen till matsmältningsbufferten (se steg 1.3) vid en koncentration av 1 mg/ml. Sterilt filtrera lösningen med ett sterilt filter på 0,22 μm.OBS: Tre ml matsmältningsbuffert per gram fett rekommenderas (dvs. för 100 g fett, förbereda 300 ml matsmältningsbuffert med 300 mg typ 2 kollagen).VARNING: Typ 2 Kollagen är farligt för ögon, hud och kan orsaka irritation i luftvägarna. Använd handskar, ögonskydd och arbeta i en ventilerad huva vid hantering av kollagen. Flytta ca 10 g fettvävnad till en 15 cm petriskål och hacka fettet försiktigt med hjälp av ett par böjdsax tills det blir en slät homogen blandning och det finns inga stora bitar av fett kvar. Upprepa processen tills allt fett har bearbetats.OBS: Varje runda bör ta ca 2 min och fettbitarna bör vara tillräckligt små så att de kan pipetted med hjälp av en bred bar pipett spets. Detta steg är avgörande för att ge högkvalitativa adipocyter. Om bitarna är för stora, matsmältningstider måste förlängas, kompromissa cell viabilty. Överför det malet fettet till 50 ml koniska rör med hjälp av en sked. Tillsätt 10 ml malet vävnad och 30 ml matsmältningsbuffert till varje rör. Skala ner till lämpliga volymer om mindre än 10 ml malet fett finns tillgängligt. Smält vävnaden vid 37 °C i en skakningsinkubator med konstant agitation vid 150 rpm i 30−45 min. Efter 30 min, kontrollera processen var 5 min för att undvika över-matsmältningen.OBS: Matsmältningen är klar när fettlösningen är homogen utan några stora bitar och har en aprikosfärg. 4. Filtrering av cellfjädring och rening av mogna Adipocyter Placera en tratt ovanpå en 1 L steril kolv och placera ett sterilt 250 μm meshfilter inuti tratten. Häll den smälta fettlösningen i filtret för att ta bort den osmälta vävnaden. När alla adipocyte fjädring har passerat genom filtret, försiktigt pressa nätfiltret för att öka avkastningen av adipocyter. Häll ca 50−100 ml tvättbuffert i filtret för att skölja det och pressa filtret igen. Häll den isolerade adipocytsuspensionen från kolven i en separationstratt och tillsätt tvättbuffert tills tratten nästan är helt fylld. Vänd försiktigt in tratten några gånger för att blanda adipocyte suspensionen med bufferten. Låt fjädringen stå i 2−3 min tills det finns en distinkt separation av 2 lager(figur 1B), med ett toppgult lager som innehåller mogna adipocyter och fri lipid och ett bottenskikt som innehåller bufferten och fettstromavaskulär fraktion (SVF). Öppna munstycket på separationstatta och häll långsamt den nedre lösningen i en steril kolv (celler från SVF kan pelleteras och samlas in efter centrifugering vid 200 x g i 7 min). Håll det översta lagret med mogna adipocyter i separationstratt. Upprepa tvättprocessen i steg 4.3−4.5 tre gånger för att noggrant tvätta de mogna adipocyterna och ta bort alla kollagen. 5. Förpackning av mogna Adipocytes Öppna munstycket och samla in den renade mogna adipocytfjädringen i 50 ml koniska rör. Packa lätt de mogna adipocyterna genom att snurra rören på 50 x g i 3 min. Använd en 18 G nål och en spruta för att ta bort den återstående tvättbufferten under adipocytsuspensionen. Ta bort det fria lipidskiktet (olja från den lilla delen av adipocyter som bröt under isoleringsproceduren) som flyter ovanpå de mogna adipocyterna med hjälp av en pipett.OBS: För att minska risken för att adipocyter kommer att droppa av membranen i steg 6.5, är det viktigt att lipidskiktet och alla tvättbuffert har tagits bort när de mogna adipocyterna är seedade på membran. Av denna anledning samla adipocyter i 3 rör. De prover som samlas in sist kommer att ha mest överföring lipid och kommer därför att vara av lägsta kvalitet. Men med noggrann rörledningar dessa prover kan användas. 6. Sådd av mogna Adipocytes Öppna förpackningen som innehåller permebara membranskär(Materials table)och ta ut membrankomponenten. Vänd den upp och ner och placera på en steril yta så att membranen vetter mot taket. Pipett 30 μl förpackade mogna adipocyter på vart och ett av membranen(figur 1C). Undvik att vidröra membranet med spetsen. Använd wide-bore pipett spetsar för att så cellerna, eller använda sax för att skära av en liten bit av en pipett spets för att göra det bredare. Vänd försiktigt in 50 ml-rören med packade adipocyter flera gånger under hela såddprocessen för att säkerställa en jämn fördelning av adipocyter med olika storlekar. Ta med de beredda multiwellplattorna som innehåller mediet från inkubatorn till biosäkerhetsskåpet och ta bort locken. Plocka upp membranen seedade med adipocyter och ta tag i den från botten så att den kan inverteras i steg 6.5. I en slät rörelse invertera membranen med adipocyter på toppen så att de seedade adipocyter nu vänd nedåt(figur 1D). Sänk plattan med adipocyter i brunnarna som innehåller media(figur 1E). Sätt locket på plattan och försiktigt överföra plattan till en vävnadskultur inkubator. Undvik snabb rörelse av plattan eftersom adipocyter lätt kan rubbas initialt.OBS: Det tar några dagar för cellerna att hålla sig fastare vid membranet. 7. Underhåll av Adipocytes och skörd för analys Ändra media minst var 7:e dag. Ta bort och tillsätt media via utskärningshålet i varje membraninsats. För att ta bort mediet, använd en spruta och en nål, en aspirating trollstav, eller en pipett med en p200 spets. För att lägga till media, använd en pipett och långsamt pipett nya medier i brunnarna längs sidan av väggen för att undvika att störa adipocyter.OBS: Adipocytes har odlats i 2 veckor med en media förändring efter 7 dagar. Olika fettursprung och experimentella frågor kan dock dra nytta av ökade medieförändringar. För att skörda RNA, ta bort mediet enligt beskrivningen i steg 7.1 och tillsätt 500 μl lysbuffert(Materialtabell)direkt i brunnarna för att lyse cellerna. För att fixa cellerna för bildbehandling, tillsätt formaldehyd direkt till brunnen vid en slutlig koncentration på 1%.OBS: Cellerna kan sedan lagras vid 4 °C.

Representative Results

Mogna adipocyter odlade som MAAC bevarar deras funktion, fenotyp, och kan användas för att studera adipocyte svar på olika farmakologiska behandlingar. Efter 1 vecka av kultur MAAC isolerade från subkutan fettvävnad upprätthålla den karakteristiska unilocular lipid dropp finns endast i mogna adipocyter(figur 2A). MAAC odlades i 1 vecka medan de behandlades med antingen PPARγ agonists rosiglitazone (Rosi) och pioglitazone (Pio), eller glukokortikooidreceptorn (GR) agonist dexametasone (Dex) för att avgöra om olika nukleära hormonreceptor (NHR) agonister köra förutspådde förändringar i nedströms mål gener i MAAC. Rosi och Pio ökade uttrycket för PPARγ responsiva gener FABP4 och LPL med 4 respektive 2−3 gånger, medan dexametason hade ingen effekt (figur 2B). På samma sätt drev dexametason robust genuttrycket för GR-målgenerna APOD och FKBP5 med 13 respektive 55 gånger, medan PPARγ-agonisterna inte hade några signifikanta effekter. Vi har tidigare visat att nyligen isolerade mänskliga mogna vita adipocyter kan transdifferentiate till en brun-liknande fenotyp i MAAC när de behandlas med Rosi10. En 7 dagars behandling med Rosi eller Pio inducerade robust genuttrycket för den bruna fettspecifika genen UCP1 med 44-65 gånger, samt ökat uttrycket av den bruna fettmarkören PDK4 12-18 gånger(figur 2C). Bild 1: Visuellt diagram över MAAC-inställningar. a)Beredning av medium. (B)Isolering och förpackning av mogna adipocyter. (C)Seedning mogna adipocyter på membran. (D)Invertera membran samtidigt som adipocyter fästs. (E)Sänka membranen i mediet och byta medium. Denna siffra har ändrats från Harms m.fl.10. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 2: MAAC upprätthåller unilocular utseende genom en vecka och svara på olika farmakologiska vånda. (A)Representativa 4x och 10x ljusa fältbilder av MAAC efter en veckas kultur. Adipocyter som har en genomsnittlig diameter på 100 μm med stora unilocular lipiddroppar är lätt att urskilja. (B)mRNA-nivåer av PPARγ målgener och glukokortikooidreceptor (GR) målgener i MAAC efter 7 dagars behandling med fordon (Vehc), rosiglitazone (Rosi), pioglitazone (Pio), eller dexametason (Dex). Rosi, Pio och Dex användes alla vid en slutlig koncentration på 10 μM.(C)mRNA-nivåer av bruna fettberikade gener i MAAC efter 7 dagars behandling med fordon (Vehc), rosiglitazone (Rosi), pioglitazone (Pio) eller dexametason (Dex). Rosi, Pio och Dex användes alla vid en slutlig koncentration på 10 μM. För alla genuttrycksdata användes TATA-bindande protein (TBP) som en intern normaliseringskontroll. Statistiken beräknades med enkelriktad ANOVA med Tukeys flera jämförelser test. (medelvärde ± SD, n = 3, *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.    

Discussion

Membran mogen adipocyte aggregerad kultur (MAAC) är en ny metod för den långsiktiga kulturen av nyisolerade mogna adipocyter. Vid inrättandet maac finns det några kritiska steg i protokollet som i hög grad påverkar avkastning, kvalitet och lönsamhet av de mogna adipocyter. Mycket arbete bör läggas på att malet fett i steg 3,2 eftersom detta steg direkt påverkar den tid adipocyter utsätts för kollagen. Om delar av fettär för stora, måste matsmältningstiden förlängas vilket negativt påverkar cellernas livskraft. Omvänt, om vävnaden bearbetas för fint med sax, kan livskraften påverkas också. För framgångsrik kultur av mogna adipocyter som MAAC, bör man ägna särskild uppmärksamhet åt följande steg: för framgångsrik sådd av adipocyter på membranen, är det viktigt att fri lipid och överföring tvätta buffert tas bort från mogna adipocyter i steg 5.3 och 5.4. Återstående lipid eller tvätt buffert kommer att minska ytspänningen i adipocyter och öka risken för adipocyter droppande-off membranen när de vänds. När adipocyterna är seedade och i media, cellerna förblir i kontakt med membranet främst genom flytkraft, alltså en långsam och mild teknik rekommenderas när du byter media för att inte förlora celler. Ta bort media från botten av brunnarna som beskrivs i steg 7.1 och lägg till media genom att långsamt pipetting media ner sidorna av väggarna. Slutligen är ett tidsbesparande förslag att förbereda plattorna med media och behandlingar innan adipocyte isoleringsprocessen. Särskilt för komplexa experimentella mönster, pre-förbereda plattorna kan spara mycket tid och säkerställer att adipocyter placeras i media med sina behandlingar så snart de är isolerade.

En fördel med att använda MAAC jämfört med att skilja preadipocytes är att MAAC media används är mycket enkel och inte kräver en ofysiologisk hormon cocktail. Här har vi odlade MAAC i glukos-rika medier (DMEM/F12), 10% FBS, 1% penn / strep, och 20 nM insulin. Viktigt, Vi har funnit att insulin absolut krävs för rosiglitazone/pioglitazone driven induktion av UCP1¹⁰. Insulin, dock, krävs inte för att upprätthålla cellernas adipogena fenotyp. Beroende på den experimentella frågan kan insulin därför inkluderas eller utelämnas.

Förfarandet ovan har optimerats för isolering och kultur av mänskliga adipocyter. Men mus, och eventuellt andra organismers adipocyter, kan också odlas som MAAC. Om mus adipocyter ska odlas som MAAC finns det ytterligare överväganden och försiktighetsåtgärder som bör hållas i åtanke. Vi har funnit att mogna adipocyter från möss är mycket bräckligare än de från människor. Som ett resultat bör matsmältningstiden förkortas till ett absolut minimum för att öka celllönsamheten. Vi fann också att adipocyter från unga möss (8 veckor gamla och yngre) gav de mest robusta och reproducerbara resultaten. Slutligen kan musen MAAC odlas i upp till en vecka, men med tanke på att deras adipogenic fenotyp verkar mindre stabil än människor (som kan odlas genom minst två veckor) rekommenderar vi odling mus MAAC för minsta nödvändiga tid att ta itu med experimentella frågor.

Eftersom MAAC-modellen är baserad på att använda genomsläppliga membran, är en fördel med denna teknik möjligheten att sammogna mogna adipocyter med andra celltyper. Vi har tidigare visat förmågan hos mogna adipocyter och makrofager att övergå med hjälp av MAAC¹⁰. Detta öppnar möjligheter att ytterligare utforska kopplingen mellan fetma, insulinresistens och immunsvar^15,16,17. Framtida experiment skulle kunna innehålla andra celltyper såsom hepatocyter, preadipocytes, endotelceller eller bukspottskörteln celler för att ytterligare öka komplexiteten och translationella relevansen av MAAC-modellen och undersöka tvärkort mellan flera celltyper.

Även om MAAC har visat sig vara överlägsen upprätthålla funktionalitet och identitet adipocyter i förhållande till andra adipocyte in vitro modeller, har det också begränsningar som måste beaktas. I jämförelse med att använda adipocyter differentierade från prekursorceller, maac är en mer mödosam och tidskrävande modell. Plattor med membran är också dyrare jämfört med vanliga cellodlingsplattor. Viktigt, mogna adipocyter måste nyligen isoleras varje gång på sådd och kan inte utvidgas eller frysas i bestånd som prekursorceller. Detta kräver således tillgång till färska vita fettvävnadsprover, men lägger också till en nivå av komplexitet som härrör från givare till givare variationer.

Här har vi lagt fram ett detaljerat protokoll för isolera nde mänskliga mogna adipocyter och inrätta MAAC. Vi har visat att adipocyter odlade som MAAC förblir livskraftig genom två veckor, deras adipogenic gen signatur bevaras, och de svarar på olika farmakologiska agonism. Med hjälp av MAAC möjliggör studier av cross-talk betweeen adipocytes och andra celltyper, och bedömningen av långsiktiga fenotypiska förändringar av mogna adipocyter som svar på olika stimuli.

Materials

Autoclaved scissors
Autoclaved spoons
Autoclaved tweezers
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A6003
Buffer RLT	QIAGEN	79216	Lysis buffer
CaCl2*2H2O	Sigma-Aldrich	C7902
Conical tubes, 50 mL
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
DMEM/F-12	Gibco	31331-028
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10270-106
Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm	Thermo Scientific	156-4020	500 mL
Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm	Thermo Scientific	158-0020	1000 mL
HBSS+CaCl2+MgCl2	Gibco	14065-49
HEPES buffer solution (1M)	Gibco	15630-056
High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit	Applied Biosystems	4368814
Insulin (Actrapid Penfill)	Novo Nordisk A/S
KCl	Merck	104936
KH2PO4	Merck	104873
Medium 199	Gibco	10012-011
Mesh filter (250 µM)	Sintab AB	6111-025043
MgSO4*7H2O	Sigma-Aldrich	M1880
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Needles, 18G, 1.20×40 mm	Sterican	613-2948
Pencillin-Streptomycin (Penn/Strep)	Gibco	15140
Petri dishes, 150×21 mm	Thermo Scientific	168381
Power SYBR Green PCR master mix	Applied Biosystems	4367659
Quantstudio 7 Flex Real-Time PCR machine	Applied Biosystems
RNeasy Mini kits	QIAGEN	74106
Separation funnel	VWR	527-0008	For large scale preparation
Separation funnel	VWR	527-0005	For small scale preparation
Shaking incubator (37 °C)
Syringes, 5 mL	Omnifix	612-2892	100 st
Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2)
Transwells, 24-well (6,5 mm)	Costar	3397	Permeable membrane inserts
TRIzol reagent	Invitrogen	10296010	Lysis buffer
Type 2 Collagenase	Worthington	LS004177