En menneskelig 3D ekstracellulær matrix-Adipocyte kultur model for at studere matrix-celle metaboliske Crosstalk
Summary
Vi beskriver en 3D menneskelige ekstracellulære matrix-adipocyte in vitro kultur system, der tillader dissektion af rollerne af matrix og adipocytter i at bidrage til fedtvæv metabolisk phenotype.
Abstract
Den ekstracellulære matrix (ECM) spiller en central rolle i reguleringen af vævs homøostase, engagerende i krydstale med celler og regulerer flere aspekter af cellulær funktion. ECM spiller en særlig vigtig rolle i fedtvæv funktion i fedme, og ændringer i fedtvæv ECM deposition og sammensætning er forbundet med metaboliske sygdom i mus og mennesker. Tractable in vitro-modeller, der tillader dissektion af rollerne for ECM og celler i at bidrage til den globale væv fænotype er sparsom. Vi beskriver en roman 3D in vitro model af human ECM-adipocyte kultur, der tillader undersøgelse af de specifikke roller ECM og adipocytter i reguleringen fedtvæv metabolisk phenotype. Humant fedtvæv er decellularized at isolere ECM, som efterfølgende genbefolket med preadipocytter, der derefter differentieret inden ECM i modne adipocytter. Denne metode skaber ECM-adipocyte konstruktioner, der er metabolisk aktive og bevarer egenskaber af væv og patienter, hvorfra de er afledt. Vi har brugt dette system til at demonstrere sygdomsspecifik ECM-adipocyt krydstale i humant fedtvæv. Denne kulturmodel giver et værktøj til at dissekere rollerne af ECM og adipocytter i at bidrage til globale fedtvæv metabolisk fænotype og tillader undersøgelse af rollen som ECM i reguleringen af fedtvæv homøostase.
Introduction
Den ekstracellulære matrix (ECM) giver ikke kun et mekanisk stillads til væv, men også en kompleks krydstale med celler, der er placeret i den, og regulerer forskellige processer, som er nødvendige for vævs homøostase, herunder celle spredning, differentiering, signalering og metabolisme1. Mens sund ECM spiller en væsentlig rolle vedligeholdelsen af normal vævs funktion, dysfunktionel ECM har været impliceret i flere sygdomme2.
Fedtvæv spiller en vigtig rolle i patogenesen af metabolisk sygdom. Fedme er forbundet med overdreven fedtcellerne hypertrofi og cellulære hypoksi, defekter i fedtcellerne cellulære metabolisme, og fedtvæv endoplasmatiske reticulum og oxidativ stress og inflammation. Mens dårligt forstået, disse komplekse processer konspirere at forringe fedtvæv næringsstof bufferkapacitet, fører til næringsstof overløb fra fedtvæv, toksicitet i flere væv, og systemisk metabolisk sygdom3,4 ,5. Sekvensen af begivenheder og specifikke mekanismer, der ligger til grund for fedtvæv svigt er dårligt forstået, men ændringer i fedtvæv ECM har været impliceret. ECM sammensætning er ændret inden fedtvæv i human og murine fedme, med øget aflejring af ECM protein sammen med kvalitative biokemiske og strukturelle forskelle i fedtvæv ECM forbundet med menneskelig metabolisk sygdom, herunder type 2 diabetes og hyperlipidæmi6,7,8,9,10,11.
På trods af disse observationer, rollen af fedtvæv ECM i mæthed fedtvæv dysfunktion er ikke veldefineret. Dette er til dels på grund af manglende spor tabel eksperimentelle modeller, der tillader dissektion af de specifikke roller ECM og adipocytter i reguleringen ultimative fedtvæv funktion. ECM-adipocyte kultur bedre simulerer in vivo miljøet af indfødte fedtvæv i mindst to henseender. For det første, ECM kultur giver et molekyle miljø svarende til indfødte fedtvæv, herunder indfødte collagens, elastiner, og andre matrix proteiner fraværende i standard 2D kultur. For det andet, kultur på 2D plast har vist sig at ændre fedtcellerne metabolisme via mekaniske effekter på grund af nedsat elasticitet af plastik substrat12, som ECM-kultur eliminerer.
Metoder til at ingeniør biologiske stilladser ved isolering af ECM fra afstødende fedtstoffer og andre væv er blevet undersøgt i forbindelse med regenerativ og rekonstruktiv medicin og vævsteknik13,14, 15,16,17,18. Vi har tidligere offentliggjort metode, hvor vi tilpassede disse metoder til at udvikle en in vitro 3D-model af human ECM-fedtcellerne kultur, ved hjælp af ECM og fedtcellerne stamceller (preadipocytter) afledt af menneskelige visceral fedtvæv11. I denne artikel beskriver vi disse metoder i detaljer. Den decellularization procedure for humant fedtvæv er en fire-dages proces, der involverer mekaniske og enzymatiske behandlinger til at fjerne celler og lipid, efterlader en biologisk stillads, der bevarer egenskaber af vævet, hvorfra det er afledt. Decellularized ECM understøtter adipogenisk differentiering af humane preadipocytter, og når det er rekonstitueret med adipocytter, vedligeholder mikroarkitektur og biokemiske og sygdomsspecifikke egenskaber af intakt fedtvæv og engagerer sig i metaboliske funktioner karakteristisk for indfødte fedtvæv. Denne matrix kan studses alene eller reseedet med celler, tillader undersøgelse af interaktioner og krydstale mellem cellulære og ekstracellulære komponenter af fedtvæv.
Protocol
Representative Results
Discussion
ECM-adipocyte kulturmodel giver et værdifuldt værktøj til at dissektere de enkelte roller af ECM og celler i diktere ultimative væv fænotype. ECM-isolations protokollen er ganske reproducerbar, men variabilitet i decellulariseringsproces kan observeres. Den dag 3 delipidation Step er et kritisk punkt i protokollen. Ved afslutningen af den overnight ekstraktion skal delipidation af matrixen dokumenteres ved den polære solvent opløsning, der bliver gul, mens matrixen skal overgå fra en gul-orange farve karakteristi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa og Retha Geiss for at hjælpe med koordinering af studier. SEM blev udført af University of Michigan mikroskopi & billedanalyse laboratorium biomedicinsk forskning kerne facilitet. Dette projekt blev støttet af NIH Grants R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), veteraner anliggender Merit Grant I01CX001811 (RWO), pilot og gennemførligheds støtte fra Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Veterans administration VISN 10 SPARK pilot Grant (RWO). Scanning elektronmikroskopi udført af University of Michigan mikroskopi & billedanalyse laboratorium biomedicinsk forskning kerne facilitet. Figur 4 i dette manuskript blev oprindeligt udgivet i Baker et al., J Clin endo Metab 2017; 1. marts 102, stk. 3, 1032-1043. Doi: 10.1210/JC. 2016-2915, og er blevet gengivet med tilladelse fra Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. For tilladelse til at genbruge dette materiale, kan du besøge http://global.oup.com/academic/rights.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#25200056 | |
| 1.5 mL cryovial tube | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#02-682-557 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#89370-094 | |
| 100 µm nylon mesh filter | Corning Inc., Corning, NY, USA | Cat#352360 | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#D8375 | |
| 2 nM 3,3’-5,Triiodo,L-thyronine sodium salt (T3) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T6397 | |
| 24-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-700 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I5879 | |
| 96-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-666 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#15240062 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#B4639 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#A8806 | |
| Buffer RLT | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#79216 | |
| Ciglitizone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#C3974 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]- | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | Cat#NET328A250UC | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4513 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4902 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP231 | Flammable, caustic |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP118 | |
| D-pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#21210 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#11320033 | |
| Ethanol | Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA | Cat#DSP-MD.43 | Flammable |
| EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#10437028 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#G5882 | Caustic |
| Hexamethyldisalizane | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#440191 | Flammable, caustic |
| Human insulin solution | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I9278 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A415 | Flammable |
| Isoproterenol | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#I5627 | Flammable |
| KCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S25484 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#P5655 | |
| Lipase from porcine pancreas, type VI-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#L0382 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#230391 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#S233 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A661 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK | Cat# AGR1180 | |
| Oil Red-O Solution (ORO) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#O1391 | |
| Oil Red-O Stain Kit | American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA | Cat#KTORO-G | |
| Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#201030 | Caustic |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#93482 | Caustic |
| Phosphate Buffered Saline Solution (PBS) | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SH3025601 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#R5125 | |
| RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#74704 | |
| Scintillation Fluid | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SX18 | |
| Scintillation Counter | |||
| Scissors, forceps, sterile | |||
| Sorensen's phosphate buffer | Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ | CAS #: 10049-21-5 | |
| T-150 culture flask | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10062-864 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#4369016 | |
| Temperature-controlled orbital shaker | |||
| Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer | Benchmark Scientific | Cat#D1030 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T3309 | |
| Triglyceride Determination Kit | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#TR0100 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Type II collagenase | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#17101015 | |
| Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#WHA5201150 |
Riferimenti
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).
- O’Rourke, R. W., Lumeng, C. N. Obesity heats up adipose tissue lymphocytes. Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).
- Engin, A. The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).
- Dankel, S. N., et al. COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size. Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).
- Divoux, A., et al. Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss. Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).
- Lackey, D. E., et al. Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).
- Muir, L. A., et al. Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity. Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).
- Spencer, M., et al. Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).
- Baker, N. A., et al. Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).
- Pellegrinelli, V., et al. Human adipocyte function is impacted by mechanical cues. Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).
- Flynn, L. E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Porzionato, A., et al. Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine. European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).
- Tebyanian, H., et al. A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering. Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
- Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O’Rourke, R. W. Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes. Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).
- O’Rourke, R. W., et al. Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia’s effects on lipid metabolism in human adipocytes. PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Tchoukalova, Y. D., et al. Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans. Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).
