Un modèle de culture matrix-adipocyte extracellulaire humaine 3D pour étudier matrix-Cell Metabolic Crosstalk
Summary
Nous décrivons un système de culture in vitro de matrice-adipocyte extracellulaire humain 3D qui permet la dissection des rôles de la matrice et des adipocytes en contribuant au phénotype métabolique de tissu adipeux.
Abstract
La matrice extracellulaire (ECM) joue un rôle central dans la régulation de l’homéostasie tissulaire, s’engageant dans le crosstalk avec les cellules et régulant de multiples aspects de la fonction cellulaire. L’ECM joue un rôle particulièrement important dans la fonction de tissu adipeux dans l’obésité, et des changements dans le dépôt et la composition d’ECM de tissu adipeux sont associés à la maladie métabolique chez les souris et les humains. Les modèles in vitro traitables qui permettent la dissection des rôles de l’ECM et des cellules en contribuant au phénotype global de tissu sont clairsemés. Nous décrivons un nouveau modèle in vitro 3D de la culture humaine d’ECM-adipocyte qui permet l’étude des rôles spécifiques de l’ECM et des adipocytes en régulant le phénotype métabolique de tissu adipeux. Le tissu adipeux humain est décellularisé pour isoler l’ECM, qui est ensuite repeuplé avec des prédipocytes qui sont ensuite différenciés dans l’ECM en adipocytes matures. Cette méthode crée des constructions ECM-adipocyte qui sont métaboliquement actives et conservent des caractéristiques des tissus et des patients dont ils sont dérivés. Nous avons utilisé ce système pour démontrer la maladie spécifique ECM-adipocyte crosstalk dans le tissu adipeux humain. Ce modèle de culture fournit un outil pour disséquer les rôles de l’ECM et des adipocytes en contribuant au phénotype métabolique global de tissu adipeux et permet l’étude du rôle de l’ECM en réglant l’homéostasie de tissu adipeux.
Introduction
La matrice extracellulaire (ECM) fournit non seulement un échafaudage mécanique pour les tissus, mais s’engage également dans le crosstalk complexe avec des cellules qui résident en elle, régulant divers processus nécessaires pour l’homéostasie tissulaire, y compris la prolifération cellulaire, différenciation, signalisation et métabolisme1. Tandis que l’ECM sain joue un rôle essentiel le maintien de la fonction normale de tissu, l’ECM dysfonctionnel a été impliqué dans les maladies multiples2.
Le tissu adipeux joue un rôle important dans la pathogénie de la maladie métabolique. L’obésité est associée à l’hypertrophie excessive d’adipocyte et à l’hypoxie cellulaire, aux défauts dans le métabolisme cellulaire d’adipocyte, et au reticulum et à l’inflammation d’endoplasmique de tissu adipeux. Bien que mal compris, ces processus complexes conspirent pour altérer la capacité de tamponde de nutriment de tissu adipeux, menant au débordement nutritif du tissu adipeux, à la toxicité dans les tissus multiples, et à la maladie métabolique systémique3,4 ,5. La séquence des événements et des mécanismes spécifiques qui sous-tendent l’échec de tissu adipeux sont mal compris, mais des altérations dans l’ECM de tissu adipeux ont été impliquées. La composition d’ECM est modifiée dans le tissu adipeux dans l’obésité humaine et murine, avec le dépôt accru de protéine d’ECM avec les différences biochimiques et structurales qualitatives dans le tissu adipeux ECM lié à la maladie métabolique humaine, y compris diabète de type 2 et hyperlipidémie6,7,8,9,10,11.
En dépit de ces observations, le rôle de l’ECM de tissu adipeux en médiatisant le dysfonctionnement adipeux de tissu n’est pas bien défini. Cela est dû en partie à un manque de modèles expérimentaux traitables qui permettent la dissection des rôles spécifiques de l’ECM et des adipocytes dans la régulation de la fonction ultime du tissu adipeux. La culture eCM-adipocyte simule mieux l’environnement in vivo du tissu adipeux indigène à au moins deux égards. Tout d’abord, la culture ECM fournit un environnement moléculaire similaire au tissu adipeux indigène, y compris les collagènes indigènes, les élastines et autres protéines matricielles absentes dans la culture 2D standard. Deuxièmement, la culture sur le plastique 2D a été montré pour modifier le métabolisme des adipocytes par des effets mécaniques en raison de l’élasticité diminuée du substrat plastique12, qui ECM-culture élimine.
Les méthodes pour concevoir des échafaudages biologiques par l’isolement de l’ECM de l’adipose décellularisé et d’autres tissus ont été étudiées dans le contexte de la médecine régénératrice et reconstructive et de l’ingénierie tissulaire13,14, 15,16,17,18. Nous avons déjà publié une méthodologie dans laquelle nous avons adapté ces méthodes pour développer un modèle 3D in vitro de la culture humaine ECM-adipocyte, en utilisant des cellules souches ECM et adipocytes (préadipocytes) dérivés de tissus adipeux viscéraux humains11. Dans le présent article, nous décrivons ces méthodes en détail. La procédure de décellularisation du tissu adipeux humain est un processus de quatre jours qui implique des traitements mécaniques et enzymatiques pour enlever les cellules et les lipides, laissant un échafaudage biologique qui maintient les caractéristiques du tissu à partir duquel il est dérivé. L’ECM décellularisé soutient la différenciation adipogénique des préadipocytes humains, et lorsqu’il est reconstitué avec des adipocytes, maintient la microarchitecture et les caractéristiques biochimiques et spécifiques à la maladie du tissu adipeux intact et s’engage dans le métabolisme fonctions caractéristiques du tissu adipeux indigène. Cette matrice peut être étudiée seule ou réensemencée avec des cellules, permettant l’étude des interactions et du croisement entre les composants cellulaires et extra-cellulaires du tissu adipeux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le modèle de culture ECM-adipocyte fournit un outil précieux pour disséquer les rôles individuels de l’ECM et des cellules dans la dictation du phénotype tissulaire ultime. Le protocole d’isolement d’ECM est tout à fait reproductible, mais la variabilité dans le processus de décellularization peut être observée. L’étape de délipidation du Jour 3 est un point critique du protocole. À l’achèvement de l’extraction de nuit, la délipidation de la matrice devrait être démontrée par la solution de solvant pola…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa et Retha Geiss pour leur aide dans la coordination des études. SEM a été réalisé par l’Université du Michigan Microscopy et L’analyse d’images Laboratoire de recherche biomédicale Core Facility. Ce projet a été soutenu par des subventions des NIH R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), Pilot and Feasibility Grant du Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Subventions pilotes VISN 10 SPARK de l’Administration des anciens combattants ( RWO). Microscopie électronique à balayage effectuée par l’University of Michigan Microscopy and Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. La figure 4 de ce manuscrit a été publiée à l’origine dans Baker et coll., J Clin Endo Metab 2017; Mar 1;102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, et a été reproduit avec la permission d’Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Pour obtenir la permission de réutiliser ce matériel, veuillez visiter http://global.oup.com/academic/rights.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#25200056 | |
| 1.5 mL cryovial tube | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#02-682-557 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#89370-094 | |
| 100 µm nylon mesh filter | Corning Inc., Corning, NY, USA | Cat#352360 | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#D8375 | |
| 2 nM 3,3’-5,Triiodo,L-thyronine sodium salt (T3) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T6397 | |
| 24-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-700 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I5879 | |
| 96-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-666 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#15240062 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#B4639 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#A8806 | |
| Buffer RLT | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#79216 | |
| Ciglitizone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#C3974 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]- | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | Cat#NET328A250UC | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4513 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4902 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP231 | Flammable, caustic |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP118 | |
| D-pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#21210 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#11320033 | |
| Ethanol | Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA | Cat#DSP-MD.43 | Flammable |
| EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#10437028 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#G5882 | Caustic |
| Hexamethyldisalizane | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#440191 | Flammable, caustic |
| Human insulin solution | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I9278 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A415 | Flammable |
| Isoproterenol | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#I5627 | Flammable |
| KCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S25484 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#P5655 | |
| Lipase from porcine pancreas, type VI-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#L0382 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#230391 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#S233 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A661 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK | Cat# AGR1180 | |
| Oil Red-O Solution (ORO) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#O1391 | |
| Oil Red-O Stain Kit | American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA | Cat#KTORO-G | |
| Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#201030 | Caustic |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#93482 | Caustic |
| Phosphate Buffered Saline Solution (PBS) | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SH3025601 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#R5125 | |
| RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#74704 | |
| Scintillation Fluid | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SX18 | |
| Scintillation Counter | |||
| Scissors, forceps, sterile | |||
| Sorensen's phosphate buffer | Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ | CAS #: 10049-21-5 | |
| T-150 culture flask | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10062-864 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#4369016 | |
| Temperature-controlled orbital shaker | |||
| Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer | Benchmark Scientific | Cat#D1030 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T3309 | |
| Triglyceride Determination Kit | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#TR0100 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Type II collagenase | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#17101015 | |
| Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#WHA5201150 |
Riferimenti
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