Ein menschliches 3D extrazelluläres Matrix-Adipozyten-Kulturmodell zum Studium der Matrix-Zell Metabolischen Crosstalk
Summary
Wir beschreiben ein 3D-Human-Human-Extrazellmatrix-Adipozyten-In-vitro-Kultursystem, das die Zerlegung der Rollen der Matrix und der Adipozyten bei der Kodipierung des metabolischen Phänotyps des Fettgewebes ermöglicht.
Abstract
Die extrazelluläre Matrix (ECM) spielt eine zentrale Rolle bei der Regulierung der Gewebehomöostase, die Einbeziehung in Crosstalk mit Zellen und die Regulierung mehrerer Aspekte der zellulären Funktion. Das ECM spielt eine besonders wichtige Rolle bei der Fettgewebefunktion bei Adipositas, und Veränderungen im Fettgewebe ECM Ablagerung und Zusammensetzung sind mit Stoffwechselerkrankungen bei Mäusen und Menschen verbunden. Tractable In-vitro-Modelle, die eine Zerlegung der Rolle des ECM und der Zellen bei der Beteiligung am globalen Gewebephänotyp ermöglichen, sind spärlich. Wir beschreiben ein neuartiges 3D-In-vitro-Modell der humanen ECM-Adipozytenkultur, das die Untersuchung der spezifischen Rollen des ECM und der Adipozyten bei der Regulierung des metabolischen Phänotyps des Fettgewebes ermöglicht. Das menschliche Fettgewebe wird dezellularisiert, um ECM zu isolieren, das anschließend mit Präsipozyten wieder aufgefüllt wird, die dann innerhalb des ECM zu reifen Adipozyten differenziert werden. Diese Methode erstellt ECM-Adipozytenkonstrukte, die metabolisch aktiv sind und Eigenschaften der Gewebe und Patienten, von denen sie abgeleitet werden, beibehalten. Wir haben dieses System verwendet, um krankheitsspezifische ECM-Adipozyten-Überlauf im menschlichen Fettgewebe nachzuweisen. Dieses Kulturmodell bietet ein Werkzeug zur Zersebung der Rolle des ECM und der Adipozyten bei der Teilnahme am globalen metabolischen Fettgewebe-Phänotyp und ermöglicht die Untersuchung der Rolle des ECM bei der Regulierung der Fettgewebehomöostase.
Introduction
Die extrazelluläre Matrix (ECM) stellt nicht nur ein mechanisches Gerüst für Gewebe bereit, sondern greift auch in komplexe Übersprachen mit Zellen ein, die sich in ihr befinden, und reguliert verschiedene Prozesse, die für die Gewebehomöostase notwendig sind, einschließlich der Zellproliferation, Differenzierung, Signalisierung und Stoffwechsel1. Während gesundes ECM eine wesentliche Rolle für die Aufrechterhaltung der normalen Gewebefunktion spielt, wurde dysfunktionales ECM in mehrere Krankheiten verwickelt2.
Adipose-Gewebe spielt eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von Stoffwechselerkrankungen. Adipositas ist verbunden mit übermäßiger Adipozytenhypertrophie und zellulärer Hypoxie, Defekten im Adipozyten-Zellstoffwechsel und adipose Gewebe endoplasmatischere Retikulum und oxidativen Stress und Entzündungen. Obwohl schlecht verstanden, konspirieren diese komplexen Prozesse, um Fettgewebe PufferungKapazität zu beeinträchtigen, was zu Nährstoffüberlauf aus Fettgewebe, Toxizität in mehreren Geweben, und systemische Stoffwechselerkrankung3,4 ,5. Die Abfolge der Ereignisse und spezifische Mechanismen, die dem Versagen des Fettgewebes zugrunde liegen, sind schlecht verstanden, aber Veränderungen im Fettgewebe ECM wurden involviert. Die ECM-Zusammensetzung wird innerhalb des Fettgewebes bei menschlicher und muriner Fettleibigkeit verändert, mit erhöhter Ablagerung von ECM-Protein zusammen mit qualitativen biochemischen und strukturellen Unterschieden im Fettgewebe ECM im Zusammenhang mit menschlichen Stoffwechselerkrankungen, einschließlich Typ-2-Diabetes und Hyperlipidämie6,7,8,9,10,11.
Trotz dieser Beobachtungen ist die Rolle des Fettgewebes ECM bei der Vermittlung von Fettgewebedysfunktion nicht genau definiert. Dies ist zum Teil auf einen Mangel an belastbaren experimentellen Modellen zurückzuführen, die eine Zerlegung der spezifischen Rollen von ECM und Adipozyten bei der Regulierung der ultimativen Fettgewebefunktion ermöglichen. Die ECM-Adipozytenkultur simuliert die In-vivo-Umgebung des nativen Fettgewebes in mindestens zwei Punkten. Erstens bietet die ECM-Kultur eine molekulare Umgebung, die nativem Fettgewebe ähnelt, einschließlich nativer Kollagene, Elastine und anderer Matrixproteine, die in der Standard-2D-Kultur fehlen. Zweitens hat sich gezeigt, dass die Kultur auf 2D-Kunststoff den Adipozytenstoffwechsel durch mechanische Effekte durch verminderte Elastizität des Kunststoffsubstrats12verändert, was die ECM-Kultur eliminiert.
Methoden zur Konstruktion biologischer Gerüste durch Isolierung von ECM aus dezellularisiertem Fett und anderen Geweben wurden im Rahmen der regenerativen und rekonstruktiven Medizin und Gewebetechnik untersucht13,14, 15,16,17,18. Wir haben bereits eine Methodik veröffentlicht, in der wir diese Methoden angepasst haben, um ein in vitro 3D-Modell der menschlichen ECM-Adipozytenkultur zu entwickeln, mit ECM und Adipozytenstammzellen (Preadipozyten), die aus humanen viszeralen Fettgeweben abgeleitet sind11. Im vorliegenden Artikel beschreiben wir diese Methoden ausführlich. Das Dezellularisierungsverfahren für menschliches Fettgewebe ist ein viertägiger Prozess, bei dem mechanische und enzymatische Behandlungen zur Entfernung von Zellen und Lipiden durchgeführt werden, wodurch ein biologisches Gerüst zurückbleibt, das die Eigenschaften des Gewebes beibehält, aus dem es gewonnen wird. Dezellularisiertes ECM unterstützt die adipogene Differenzierung menschlicher Präadiipozyten und bei Rekonstitution mit Adipozyten, behält mikrochemische und biochemische und krankheitsspezifische Eigenschaften intakten Fettgewebes bei und beteiligt sich an metabolischen Funktionen, die für natives Fettgewebe charakteristisch sind. Diese Matrix kann allein untersucht oder mit Zellen neu gesät werden, was eine Untersuchung von Wechselwirkungen und Übersprechen zwischen den zellulären und extrazellulären Komponenten des Fettgewebes ermöglicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das ECM-Adipozyten-Kulturmodell bietet ein wertvolles Werkzeug, um die individuellen Rollen von ECM und Zellen bei der Diktat des ultimativen Gewebephänotyps zu sezieren. Das ECM-Isolationsprotokoll ist sehr reproduzierbar, aber die Variabilität im Dezellularisierungsprozess kann beobachtet werden. Der Tag-3-Delipidierungsschritt ist ein kritischer Punkt im Protokoll. Nach Abschluss der nächtlichen Extraktion sollte die Delipidisierung der Matrix durch das Gelbdrehen der PolarSolventlösung nachgewiesen werden, währe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa und Retha Geiss für die Unterstützung bei der Studienkoordination. SEM wurde von der University of Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility durchgeführt. Dieses Projekt wurde unterstützt durch NIH-Stipendien R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), Pilot and Feasibility Grant vom Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Veterans Administration VISN 10 SPARK Pilot Grant (RWO). Rasterelektronenmikroskopie der University of Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. Abbildung 4 dieses Manuskripts wurde ursprünglich in Baker et al., J Clin Endo Metab 2017 veröffentlicht; 1.10.102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, und wurde mit Genehmigung der Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329] reproduziert. Für die Erlaubnis, dieses Material wiederzuverwenden, besuchen Sie bitte http://global.oup.com/academic/rights.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#25200056 | |
| 1.5 mL cryovial tube | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#02-682-557 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#89370-094 | |
| 100 µm nylon mesh filter | Corning Inc., Corning, NY, USA | Cat#352360 | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#D8375 | |
| 2 nM 3,3’-5,Triiodo,L-thyronine sodium salt (T3) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T6397 | |
| 24-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-700 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I5879 | |
| 96-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-666 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#15240062 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#B4639 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#A8806 | |
| Buffer RLT | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#79216 | |
| Ciglitizone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#C3974 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]- | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | Cat#NET328A250UC | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4513 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4902 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP231 | Flammable, caustic |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP118 | |
| D-pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#21210 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#11320033 | |
| Ethanol | Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA | Cat#DSP-MD.43 | Flammable |
| EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#10437028 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#G5882 | Caustic |
| Hexamethyldisalizane | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#440191 | Flammable, caustic |
| Human insulin solution | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I9278 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A415 | Flammable |
| Isoproterenol | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#I5627 | Flammable |
| KCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S25484 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#P5655 | |
| Lipase from porcine pancreas, type VI-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#L0382 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#230391 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#S233 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A661 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK | Cat# AGR1180 | |
| Oil Red-O Solution (ORO) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#O1391 | |
| Oil Red-O Stain Kit | American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA | Cat#KTORO-G | |
| Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#201030 | Caustic |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#93482 | Caustic |
| Phosphate Buffered Saline Solution (PBS) | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SH3025601 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#R5125 | |
| RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#74704 | |
| Scintillation Fluid | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SX18 | |
| Scintillation Counter | |||
| Scissors, forceps, sterile | |||
| Sorensen's phosphate buffer | Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ | CAS #: 10049-21-5 | |
| T-150 culture flask | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10062-864 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#4369016 | |
| Temperature-controlled orbital shaker | |||
| Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer | Benchmark Scientific | Cat#D1030 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T3309 | |
| Triglyceride Determination Kit | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#TR0100 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Type II collagenase | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#17101015 | |
| Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#WHA5201150 |
Riferimenti
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