Descriviamo un sistema 3D di coltura extracellulare extracellulare umana-adipocito in vitro che permette la dissezione dei ruoli della matrice e adipociti nel contribuire al fenotipo metabolico del tessuto adiposo.
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Articolo metodologico
Un modello di coltura a matrice extracellulare extracellulare -adipocyte umano per lo studio del crosstalk metabolico a matrice
In questo articolo
Sommario
Abstract
La matrice extracellulare (ECM) svolge un ruolo centrale nella regolazione dell'omeostasi dei tessuti, impegnandosi in crosstalk con le cellule e regolando molteplici aspetti della funzione cellulare. L'ECM svolge un ruolo particolarmente importante nella funzione adiposa del tessuto nell'obesità e le alterazioni nella deposizione e nella composizione eM del tessuto adiposo sono associate alla malattia metabolica nei topi e negli esseri umani. I modelli in vitro trattabili che consentono la dissezione dei ruoli dell'ECM e delle cellule nel contribuire al fenotipo dei tessuti globali sono scarsi. Descriviamo un nuovo modello 3D in vitro della coltura umana ECM-adipocite che permette di studiare i ruoli specifici dell'ECM e gli adipociti nella regolazione del fenotipo metabolico del tessuto adiposo. Il tessuto adiposo umano viene decellularizzato per isolare l'ECM, che viene successivamente ripopolato con precari che vengono poi differenziati all'interno dell'ECM in adipociti maturi. Questo metodo crea costrutti ECM-adipocite che sono metabolicamente attivi e mantengono le caratteristiche dei tessuti e dei pazienti da cui derivano. Abbiamo usato questo sistema per dimostrare il crosstalk ECM-adipocite specifico della malattia nel tessuto adiposo umano. Questo modello di coltura fornisce uno strumento per sezionare i ruoli dell'ECM e degli adipociti nel contribuire al fenotipo metabolico del tessuto adiposo globale e permette di studiare il ruolo dell'ECM nella regolazione dell'omeostasi dei tessuti adisposti.
Introduzione
La matrice extracellulare (ECM) non solo fornisce uno scaffold meccanico per i tessuti, ma si impegna anche in complesse interazioni incrociate con cellule che risiedono al suo interno, regolando i diversi processi necessari per l'omeostasi dei tessuti, compresa la proliferazione cellulare, differenziazione, segnalazione e metabolismo1. Mentre l'ECM sano svolge un ruolo essenziale nel mantenimento della normale funzione tissutale, l'ECM disfunzionale è stato implicato in più malattie2.
Il tessuto adiposo svolge un ruolo importante nella patogenesi della malattia metabolica. L'obesità è associa....
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Protocollo
Tessuti adiposi sono acquistati da soggetti umani sottoposti a chirurgia bariatrica elettiva sotto l'approvazione del comitato di revisione istituzionale.
1. Isolamento dei preadipociti e preparazione del reagente culturale
- Preparare il 2% di albumina di siero bovino (BSA) in 1x soluzione salina tamponata da fosfato (PBS). Filtrare sterilizzare, e conservare a 4 gradi centigradi.
- Preparare collagenasi di tipo II: 2 mg/mL nel 2% BSA in 1x PBS. Preparare immediatamente prima dell'uso.
- Preparare la soluzione di lisiera deionizzata del Red Blood Cell (RBC): 1,5 M NH4Cl, 100 mM NaHCO3, 10 mM di....
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Risultati
Preparazione del tessuto adiposo, semina con preadipociti e differenziazione in vitro in adipociti maturi provocano chiari cambiamenti morfologici sequenziali nel tessuto che consente la valutazione visiva del progresso in tutto il protocollo (Figura 1) . I preadipociti utilizzati per il seeding dell'ECM sono isolati utilizzando la digestione del collagene e da campioni separati di IVA (Figura 2). La microscopia elettronica a sca.......
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Discussione
Il modello di coltura ECM-adipocyte fornisce uno strumento prezioso per sezionare i singoli ruoli dell'ECM e delle cellule nella dettatura del fenotipo tissutale finale. Il protocollo di isolamento ECM è abbastanza riproducibile, ma si può osservare la variabilità nel processo di decellularizzazione. La fase di delipidazione del Giorno 3 è un punto critico del protocollo. Al termine dell'estrazione notturna, la deilpidazione della matrice dovrebbe essere evidenziata dalla Polar Solvent Solution che diventa gialla, mentre.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi contrastanti.
Ringraziamenti
Ringraziamo Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa e Retha Geiss per l'assistenza con il coordinamento dello studio. SEM è stata eseguita dalla University of Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. Questo progetto è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), Pilot e Feasibility Grant del Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Amministrazione veterani VISN 10 SPARK Pilot Grant (RWO). Microscopia elettronica a scansione eseguita dall'Università del Michigan Microscopy & Image Analysis Lab....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,25% tripsina-EDTA | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#25200056 | |
| 1,5 mL provetta crioviale | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#02-682-557 | |
| 10% Formalina tamponata neutra | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#89370-094 | |
| 100 µ m filtro a rete in nylon | Corning Inc., Corning, NY, USA | Cat#352360 | |
| 2-Deossi-D-glucosio | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#D8375 | |
| 2 nM 3,3',5-Triiodo-L-tironina sale sodico (T3) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T6397 | |
| Piastre per coltura tissutale a 24 pozzetti | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-700 | |
| 3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I5879 | |
| Piastre per coltura tissutale a 96 pozzetti | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-666 | |
| Soluzione antibiotico-antimicotica (ABAM) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#15240062 | |
| Biotina | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#B4639 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#A8806 | |
| Buffer RLT | Qiagen, Hilden, Germania | Cat#79216 | |
| Ciglitizone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#C3974 | |
| Deossi-D-glucosio, 2-[1,2-3H (N)]- | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | Cat#NET328A250UC | |
| Desossiribonucleasi I da pancreas bovino, tipo II-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4513 | |
| Desametasone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4902 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP231 | Infiammabile, caustico |
| Disodio EDTA | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP118 | |
| Acido D-pantotenico sale emicalcico | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#21210 | |
| Dulbecco' s Eagle Medium modificato: Miscela di nutrienti F-12 (DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#11320033 | |
| Ethanol | Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA | Cat#DSP-MD.43 | Vetrini per |
| il conteggio delle cellule EVE infiammabili, NanoEnTek | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#10437028 | |
| Glutaraldeide | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#G5882 | |
| Esametildisalizane | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#440191 | infiammabile e caustica |
| Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I9278 | ||
| Isopropanolo | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A415 | Isoproterenolo infiammabile |
| Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#I5627 | Infiammabile | |
| KCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S25484 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#P5655 | |
| Lipasi da pancreas suino, tipo VI-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#L0382 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#230391 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#S233 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A661 | |
| Taglio ottimale composto di temperatura (OCT) | Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, Regno Unito | Cat# AGR1180 | |
| Oil Red-O Solution (ORO) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#O1391 | |
| Oil Red-O Stain Kit | American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA | Cat#KTORO-G | |
| Tetrossido di osmio | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#201030 | Caustico |
| Fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#93482 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato caustico (PBS) | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SH3025601 | |
| Ribonucleasi A dal pancreas bovino, tipo III-A | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#R5125 | |
| RNAEsito tessuto fibroso MiniKit | Qiagen, Hilden, Germania | Cat#74704 | |
| Fluido a scintillazione | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SX18 | |
| Forbici contatore | |||
| , pinze, | |||
| di Sorensen | Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ | CAS #: 10049-21-5 | |
| Pallone di coltura T-150 | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10062-864 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#4369016 | |
| Agitatore orbitale a temperatura controllata Omogeneizzatore | |||
| tissutale, Omogeneizzatore per microprovette | BeadBug Benchmark Scientific | Cat#D1030 | |
| Transferrina | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T3309 | |
| Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#TR0100 | ||
| Colorazione blu di tripano, 0,4% | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Collagenasi di tipo II | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#17101015 | |
| Carta da filtro Whatman Reeve Angel, grado 201, 150 mm | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Gatto # WHA5201150 |
Riferimenti
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Trayhurn, P.
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Ristampe e permessi
