मैट्रिक्स-सेल मेटाबोलिक क्रॉसटॉक का अध्ययन करने के लिए एक मानव 3 डी एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स-एडिपोसाइट संस्कृति मॉडल
Summary
हम विट्रो संस्कृति प्रणाली में 3 डी मानव बाह्य मैट्रिक्स-आदिपोसाइट का वर्णन करते हैं जो मैट्रिक्स और आदिपोसाइट्स की भूमिकाओं के विच्छेदन को ऊतक मेटाबोलिक फेनोटाइप में योगदान करने की अनुमति देता है।
Abstract
एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) ऊतक होमोस्टासिस को विनियमित करने, कोशिकाओं के साथ क्रॉसटॉक में उलझाने और सेलुलर फ़ंक्शन के कई पहलुओं को विनियमित करने में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है। ईसीएम मोटापे में ऊतक समारोह को कम करने में विशेष रूप से महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और एडीपोज ऊतक ईसीएम जमाव और संरचना में परिवर्तन चूहों और मनुष्यों में मेटाबोलिक रोग से जुड़े होते हैं। विट्रो मॉडल में ट्रैक करने योग्य है कि वैश्विक ऊतक फेनोटाइप में योगदान में ईसीएम और कोशिकाओं की भूमिकाओं के विच्छेदन की अनुमति विरल हैं । हम मानव ईसीएम-आदिपोसाइट संस्कृति के एक उपन्यास 3डी इन विट्रो मॉडल का वर्णन करते हैं जो एडीपोज ऊतक मेटाबोलिक फेनोटाइप को विनियमित करने में ईसीएम और एडीपोसाइट्स की विशिष्ट भूमिकाओं के अध्ययन की अनुमति देता है। मानव एडीपोज़ ऊतक को ईसीएम को अलग करने के लिए विसेमिलीकृत किया जाता है, जिसे बाद में पेरीडपोसाइट्स के साथ फिर से आबाद किया जाता है जो तब ईसीएम के भीतर परिपक्व आदिपोसाइट्स में अंतर करते हैं। यह विधि ईसीएम-आदिपोसाइट निर्माण बनाती है जो चयापचय रूप से सक्रिय होती हैं और ऊतकों और रोगियों की विशेषताओं को बनाए रखती हैं जिनसे वे प्राप्त होते हैं। हमने मानव एडीपोज ऊतक में रोग-विशिष्ट ईसीएम-आदिपोसाइट क्रॉसटॉक प्रदर्शित करने के लिए इस प्रणाली का उपयोग किया है। यह संस्कृति मॉडल वैश्विक एडीपोज ऊतक मेटाबोलिक फेनोटाइप में योगदान करने में ईसीएम और एडीपोसाइट्स की भूमिकाओं को विच्छेदन करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है और एडीपोज ऊतक होमोस्टोसिस को विनियमित करने में ईसीएम की भूमिका के अध्ययन की अनुमति देता है।
Introduction
बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) न केवल ऊतकों के लिए एक यांत्रिक पाड़ प्रदान करता है, बल्कि कोशिकाओं के साथ जटिल क्रॉसटॉक में भी संलग्न है जो इसके भीतर रहते हैं, कोशिका प्रसार सहित ऊतक होमोस्टासिस के लिए आवश्यक विविध प्रक्रियाओं को विनियमित करते हैं, भेदभाव, सिग्नलिंग, और चयापचय1. जबकि स्वस्थ ईसीएम सामान्य ऊतक समारोह के रखरखाव के लिए एक आवश्यक भूमिका निभाता है, बेकार ईसीएम कई बीमारियों2में फंसाया गया है ।
मेटाबोलिक रोग के रोगजनकता में एडीपोज ऊतक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। मोटापा अत्यधिक आदिपोसाइट हाइपरट्रॉफी और सेलुलर हाइपोक्सिया, एडीपोसाइट सेलुलर मेटाबोलिज्म में दोष, और ऊतक एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम और ऑक्सीडेटिव तनाव और सूजन को कम करता है। जबकि खराब समझ में आता है, ये जटिल प्रक्रियाएं ऊतक पोषक तत्व बफरिंग क्षमता को ख़राब करने की साजिश करती हैं, जिससे एडीपोस ऊतक, कई ऊतकों में विषाक्तता, और प्रणालीगत मेटाबोलिक रोग3,4 से पोषक तत्व ओवरफ्लो होते हैं ,5. घटनाओं और विशिष्ट तंत्र है कि ऊतक विफलता को कम करने के अनुक्रम खराब समझ रहे हैं, लेकिन adipose ऊतक ECM में परिवर्तन फंसाया गया है । ईसीएम संरचना मानव और मूत्र मोटापे में एडीपोज ऊतक के भीतर बदल जाती है, जिसमें ईसीएम प्रोटीन के बढ़ते जमाव के साथ-साथ मानव मेटाबोलिक रोग से जुड़े एडीपोस ऊतक ईसीएम में गुणात्मक जैव रासायनिक और संरचनात्मक अंतर शामिल हैं। टाइप 2 डायबिटीज और हाइपरलिपिडेमिया6,7,8,9,10,11.
इन टिप्पणियों के बावजूद, एडीपोस ऊतक रोग मध्यस्थता में एडीपोज ऊतक ईसीएम की भूमिका अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है। यह ट्रैक करने योग्य प्रयोगात्मक मॉडलों की कमी के कारण भाग में है जो अंतिम एडीपोस ऊतक फ़ंक्शन को विनियमित करने में ईसीएम और आदिपोसाइट्स की विशिष्ट भूमिकाओं के विच्छेदन की अनुमति देते हैं। ईसीएम-आदिपोसाइट संस्कृति कम से कम दो मामलों में देशी एडीपोस ऊतक के वीवो वातावरण में बेहतर अनुकरण करती है। सबसे पहले, ईसीएम संस्कृति देशी एडीपोज ऊतक के समान एक आणविक वातावरण प्रदान करती है, जिसमें देशी कोलेजन, इलास्टिन और अन्य मैट्रिक्स प्रोटीन मानक 2डी संस्कृति में अनुपस्थित होते हैं। दूसरे, 2डी प्लास्टिक पर संस्कृति को प्लास्टिक सब्सट्रेट12की लोच में कमी के कारण यांत्रिक प्रभावों के माध्यम से आदिपोसाइट चयापचय को बदलने के लिए दिखाया गया है, जो ईसीएम-संस्कृति समाप्त हो जाती है।
पुनर्योजी और पुनर्निर्माण दवा और ऊतक इंजीनियरिंग13,14के संदर्भ में ईसीएम के अलगाव से जैविक मचानों को इंजीनियर करने के तरीकों का अध्ययन किया गया है, 15,16,17,18. हमने पहले कार्यप्रणाली प्रकाशित की है जिसमें हमने मानव ईसीएम-आदिपोसाइट संस्कृति के इन विट्रो 3डी मॉडल को विकसित करने के लिए इन तरीकों को अनुकूलित किया है, जिसमें मानव आंत से प्राप्त ईसीएम और आदिपोसाइट स्टेम सेल (preadipocytes) का उपयोग करके11ऊतकों को प्राप्त किया गया है। वर्तमान लेख में हम इन तरीकों का विस्तार से वर्णन करते हैं। मानव एडीपोज ऊतक के लिए विशिष्ठता प्रक्रिया एक चार दिवसीय प्रक्रिया है जिसमें कोशिकाओं और लिपिड को हटाने के लिए यांत्रिक और एंजाइमैटिक उपचार शामिल हैं, एक जैविक पाड़ छोड़ना जो ऊतक की विशेषताओं को बनाए रखता है जिससे यह प्राप्त होता है। Decellularized ECM मानव preadipocytes के आदिपोजेनिक भेदभाव का समर्थन करता है, और जब आदिपोसाइट्स के साथ पुनर्गठित, माइक्रोआर्किटेक्चर और जैव रासायनिक और रोग-अक्षुण्ण एडीपोज ऊतक की विशिष्ट विशेषताओं को बनाए रखता है और मेटाबोलिक में संलग्न है देशी एडीपोस ऊतक की विशेषता कार्य करता है। इस मैट्रिक्स का अकेले अध्ययन किया जा सकता है या कोशिकाओं के साथ फिर से बीज ित किया जा सकता है, जिससे एडीपोस ऊतक के सेलुलर और अतिरिक्त सेलुलर घटकों के बीच बातचीत और क्रॉसटॉक के अध्ययन की अनुमति दी जा सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ईसीएम-एडिपोसाइट संस्कृति मॉडल अंतिम ऊतक फेनोटाइप को हुक्म देने में ईसीएम और कोशिकाओं की व्यक्तिगत भूमिकाओं को विच्छेदन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है। ईसीएम आइसोलेशन प्रोटोकॉल काफी प?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अध्ययन समन्वय के साथ सहायता के लिए डेनिएल बर्जर, मर्लिन वुड्रफ, सिमोन कोरिया और रीठा गीस का शुक्रिया अदा करते हैं । एसईएम मिशिगन विश्वविद्यालय माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण प्रयोगशाला बायोमेडिकल रिसर्च कोर सुविधा द्वारा किया गया था। इस परियोजना को एनआईएच अनुदान R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, द्वारा समर्थित किया गया था, सीएनएल), R01DK090262 (CNL), दिग्गजों मामलों योग्यता अनुदान I01CX001811 (RWO), पायलट और मिशिगन मधुमेह अनुसंधान केंद्र (NIH अनुदान P30-DK020572) (RWO), से व्यवहार्यता अनुदान दिग्गजों प्रशासन VISN 10 स्पार्क पायलट ग्रांट (RWO) । स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी मिशिगन विश्वविद्यालय माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण प्रयोगशाला बायोमेडिकल रिसर्च कोर सुविधा द्वारा प्रदर्शन किया। इस पांडुलिपि का चित्र4 मूल रूप से बेकर एट अल, जे क्लिन एंडो मेट 2017 में प्रकाशित किया गया था; मार्च 1;102 (3), 1032-1043 । दोई: 10.1210/jc.2016-2915, और ऑक्सफोर्ड यूनिवर्सिटी प्रेस [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329] की अनुमति से पुन: पेश किया गया है । इस सामग्री का पुन: उपयोग करने की अनुमति के लिए, कृपया http://global.oup.com/academic/rights पर जाएं।
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#25200056 | |
| 1.5 mL cryovial tube | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#02-682-557 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#89370-094 | |
| 100 µm nylon mesh filter | Corning Inc., Corning, NY, USA | Cat#352360 | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#D8375 | |
| 2 nM 3,3’-5,Triiodo,L-thyronine sodium salt (T3) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T6397 | |
| 24-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-700 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I5879 | |
| 96-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-666 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#15240062 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#B4639 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#A8806 | |
| Buffer RLT | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#79216 | |
| Ciglitizone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#C3974 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]- | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | Cat#NET328A250UC | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4513 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4902 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP231 | Flammable, caustic |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP118 | |
| D-pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#21210 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#11320033 | |
| Ethanol | Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA | Cat#DSP-MD.43 | Flammable |
| EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#10437028 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#G5882 | Caustic |
| Hexamethyldisalizane | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#440191 | Flammable, caustic |
| Human insulin solution | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I9278 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A415 | Flammable |
| Isoproterenol | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#I5627 | Flammable |
| KCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S25484 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#P5655 | |
| Lipase from porcine pancreas, type VI-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#L0382 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#230391 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#S233 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A661 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK | Cat# AGR1180 | |
| Oil Red-O Solution (ORO) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#O1391 | |
| Oil Red-O Stain Kit | American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA | Cat#KTORO-G | |
| Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#201030 | Caustic |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#93482 | Caustic |
| Phosphate Buffered Saline Solution (PBS) | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SH3025601 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#R5125 | |
| RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#74704 | |
| Scintillation Fluid | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SX18 | |
| Scintillation Counter | |||
| Scissors, forceps, sterile | |||
| Sorensen's phosphate buffer | Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ | CAS #: 10049-21-5 | |
| T-150 culture flask | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10062-864 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#4369016 | |
| Temperature-controlled orbital shaker | |||
| Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer | Benchmark Scientific | Cat#D1030 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T3309 | |
| Triglyceride Determination Kit | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#TR0100 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Type II collagenase | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#17101015 | |
| Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#WHA5201150 |
Riferimenti
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