Un modello di coltura a matrice extracellulare extracellulare -adipocyte umano per lo studio del crosstalk metabolico a matrice
Summary
Descriviamo un sistema 3D di coltura extracellulare extracellulare umana-adipocito in vitro che permette la dissezione dei ruoli della matrice e adipociti nel contribuire al fenotipo metabolico del tessuto adiposo.
Abstract
La matrice extracellulare (ECM) svolge un ruolo centrale nella regolazione dell’omeostasi dei tessuti, impegnandosi in crosstalk con le cellule e regolando molteplici aspetti della funzione cellulare. L’ECM svolge un ruolo particolarmente importante nella funzione adiposa del tessuto nell’obesità e le alterazioni nella deposizione e nella composizione eM del tessuto adiposo sono associate alla malattia metabolica nei topi e negli esseri umani. I modelli in vitro trattabili che consentono la dissezione dei ruoli dell’ECM e delle cellule nel contribuire al fenotipo dei tessuti globali sono scarsi. Descriviamo un nuovo modello 3D in vitro della coltura umana ECM-adipocite che permette di studiare i ruoli specifici dell’ECM e gli adipociti nella regolazione del fenotipo metabolico del tessuto adiposo. Il tessuto adiposo umano viene decellularizzato per isolare l’ECM, che viene successivamente ripopolato con precari che vengono poi differenziati all’interno dell’ECM in adipociti maturi. Questo metodo crea costrutti ECM-adipocite che sono metabolicamente attivi e mantengono le caratteristiche dei tessuti e dei pazienti da cui derivano. Abbiamo usato questo sistema per dimostrare il crosstalk ECM-adipocite specifico della malattia nel tessuto adiposo umano. Questo modello di coltura fornisce uno strumento per sezionare i ruoli dell’ECM e degli adipociti nel contribuire al fenotipo metabolico del tessuto adiposo globale e permette di studiare il ruolo dell’ECM nella regolazione dell’omeostasi dei tessuti adisposti.
Introduction
La matrice extracellulare (ECM) non solo fornisce uno scaffold meccanico per i tessuti, ma si impegna anche in complesse interazioni incrociate con cellule che risiedono al suo interno, regolando i diversi processi necessari per l’omeostasi dei tessuti, compresa la proliferazione cellulare, differenziazione, segnalazione e metabolismo1. Mentre l’ECM sano svolge un ruolo essenziale nel mantenimento della normale funzione tissutale, l’ECM disfunzionale è stato implicato in più malattie2.
Il tessuto adiposo svolge un ruolo importante nella patogenesi della malattia metabolica. L’obesità è associata a ipertrofia eccessiva adipocite e ipossidi cellulare, difetti nel metabolismo cellulare adipocitico, e reticolato endoplasmico del tessuto adiposo e stress ossidativo e infiammazione. Anche se poco compresi, questi processi complessi cospirano per compromettere la capacità di tamponamento dei nutrienti del tessuto adiposo, portando a overflow dei nutrienti dal tessuto adiposo, tossicità nei tessuti multipli e malattia metabolica sistemica3,4 ,5. La sequenza di eventi e meccanismi specifici che sono alla base dell’insufficienza del tessuto adiposo sono poco conosciuti, ma sono state implicate alterazioni nel tessuto adiposo ECM. La composizione ECM è alterata all’interno del tessuto adiposo nell’obesità umana e murina, con una maggiore deposizione di proteine ECM insieme a differenze biochimiche e strutturali qualitative nel tessuto adiposo associato alla malattia metabolica umana, tra cui diabete di tipo 2 e iperlipidemia6,7,8,9,10,11.
Nonostante queste osservazioni, il ruolo del tessuto adiposo ECM nella mediazione della disfunzione del tessuto adiposo non è ben definito. Ciò è in parte dovuto alla mancanza di modelli sperimentali trattabili che consentono la dissezione dei ruoli specifici dell’ECM e degli adipociti nella regolazione della funzione adiposa finale dei tessuti. La coltura ECM-adipocite simula meglio l’ambiente in vivo del tessuto nativo adiposo in almeno due aspetti. In primo luogo, la coltura ECM fornisce un ambiente molecolare simile al tessuto adiposo nativo, tra cui collageni nativi, elastine e altre proteine matriciali assenti nella coltura 2D standard. In secondo luogo, la coltura sulla plastica 2D ha dimostrato di alterare il metabolismo degli adipociti attraverso effetti meccanici a causa della diminuzione dell’elasticità del substratoplastico 12, che ECM-cultura elimina.
I metodi per progettare scaffold biologici isolando l’ECM dall’adiposi decellularizzato e da altri tessuti sono stati studiati nel contesto della medicina rigenerativa e ricostruttiva e dell’ingegneria tissutale13,14, 15,16,17,18. Abbiamo precedentemente pubblicato una metodologia in cui abbiamo adattato questi metodi per sviluppare un modello in vitro 3D di coltura umana ECM-adipocyte, utilizzando ECM e cellule staminali adipocite (preadipociti) derivate da tessuti adipose viscerali umani11. Nel presente articolo vengono descritti questi metodi in dettaglio. La procedura di decellularizzazione per il tessuto adiposo umano è un processo di quattro giorni che prevede trattamenti meccanici ed enzimatici per rimuovere cellule e lipidi, lasciando uno scaffold biologico che mantiene le caratteristiche del tessuto da cui è derivato. L’ECM decellularizzato supporta la differenziazione adipogenica dei preadipociti umani e, se ricostituita con adipociti, mantiene la microarchitettura e le caratteristiche biochimiche e specifiche della malattia del tessuto adiposo intatto e si impegna in funzioni caratteristiche del tessuto adiposo nativo. Questa matrice può essere studiata da sola o reseeded con le cellule, permettendo lo studio delle interazioni e crosstalk tra i componenti cellulari ed extracellulari del tessuto adiposo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il modello di coltura ECM-adipocyte fornisce uno strumento prezioso per sezionare i singoli ruoli dell’ECM e delle cellule nella dettatura del fenotipo tissutale finale. Il protocollo di isolamento ECM è abbastanza riproducibile, ma si può osservare la variabilità nel processo di decellularizzazione. La fase di delipidazione del Giorno 3 è un punto critico del protocollo. Al termine dell’estrazione notturna, la deilpidazione della matrice dovrebbe essere evidenziata dalla Polar Solvent Solution che diventa gialla, me…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa e Retha Geiss per l’assistenza con il coordinamento dello studio. SEM è stata eseguita dalla University of Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. Questo progetto è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), Pilot e Feasibility Grant del Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Amministrazione veterani VISN 10 SPARK Pilot Grant (RWO). Microscopia elettronica a scansione eseguita dall’Università del Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. La figura 4 di questo manoscritto è stata originariamente pubblicata in Baker et al., J Clin Endo Metab 2017; Mar 1;102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, ed è stato riprodotto su autorizzazione della Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Per il permesso di riutilizzare questo materiale, si prega di visitare http://global.oup.com/academic/rights.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#25200056 | |
| 1.5 mL cryovial tube | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#02-682-557 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#89370-094 | |
| 100 µm nylon mesh filter | Corning Inc., Corning, NY, USA | Cat#352360 | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#D8375 | |
| 2 nM 3,3’-5,Triiodo,L-thyronine sodium salt (T3) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T6397 | |
| 24-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-700 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I5879 | |
| 96-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-666 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#15240062 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#B4639 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#A8806 | |
| Buffer RLT | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#79216 | |
| Ciglitizone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#C3974 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]- | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | Cat#NET328A250UC | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4513 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4902 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP231 | Flammable, caustic |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP118 | |
| D-pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#21210 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#11320033 | |
| Ethanol | Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA | Cat#DSP-MD.43 | Flammable |
| EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#10437028 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#G5882 | Caustic |
| Hexamethyldisalizane | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#440191 | Flammable, caustic |
| Human insulin solution | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I9278 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A415 | Flammable |
| Isoproterenol | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#I5627 | Flammable |
| KCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S25484 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#P5655 | |
| Lipase from porcine pancreas, type VI-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#L0382 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#230391 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#S233 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A661 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK | Cat# AGR1180 | |
| Oil Red-O Solution (ORO) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#O1391 | |
| Oil Red-O Stain Kit | American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA | Cat#KTORO-G | |
| Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#201030 | Caustic |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#93482 | Caustic |
| Phosphate Buffered Saline Solution (PBS) | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SH3025601 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#R5125 | |
| RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#74704 | |
| Scintillation Fluid | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SX18 | |
| Scintillation Counter | |||
| Scissors, forceps, sterile | |||
| Sorensen's phosphate buffer | Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ | CAS #: 10049-21-5 | |
| T-150 culture flask | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10062-864 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#4369016 | |
| Temperature-controlled orbital shaker | |||
| Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer | Benchmark Scientific | Cat#D1030 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T3309 | |
| Triglyceride Determination Kit | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#TR0100 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Type II collagenase | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#17101015 | |
| Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#WHA5201150 |
Riferimenti
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