A Human 3D ekstracellulære Matrix-Adipocyte kultur modell for å studere Matrix-Cell metabolsk crosstalk
Summary
Vi beskriver en 3D Human ekstracellulære Matrix-adipocyte in vitro kultur system som tillater Disseksjon av rollene til matrisen og adipocytter i å bidra til fettvev metabolske fenotype.
Abstract
Den ekstracellulære matrise (ECM) spiller en sentral rolle i å regulere vev homeostase, engasjere seg i crosstalk med celler og regulere flere aspekter av cellulære funksjon. ECM spiller en spesielt viktig rolle i fettvev funksjon i fedme, og endringer i fettvev ECM avsetning og sammensetning er forbundet med metabolsk sykdom hos mus og mennesker. Medgjørlig in vitro modeller som tillater Disseksjon av rollene til ECM og celler i å bidra til global vev fenotype er sparsom. Vi beskriver en roman 3D in vitro modell av menneskelig ECM-adipocyte kultur som tillater studier av de spesifikke rollene til ECM og adipocytter i regulering fettvev metabolsk fenotype. Humant fettvev er decellularized å isolere ECM, som senere repopulated med preadipocytes som deretter skilles innenfor ECM i modne adipocytter. Denne metoden skaper ECM-adipocyte konstruksjoner som er metabolically aktive og beholde egenskapene til vev og pasienter som de er avledet. Vi har brukt dette systemet til å demonstrere sykdoms spesifikk ECM-adipocyte crosstalk i humant fettvev. Denne kulturen modellen gir et verktøy for å dissekere rollene til ECM og adipocytter i å bidra til globale fettvev metabolske fenotype og tillatelser studie av rollen til ECM i regulering fettvev homeostase.
Introduction
Ekstracellulære matrise (ECM) gir ikke bare et mekanisk stillas for vev, men også engasjerer seg i komplekse crosstalk med celler som ligger innenfor det, regulere ulike prosesser som er nødvendige for vev homeostase, inkludert celle spredning, differensiering, signalering, og metabolisme1. Mens sunn ECM spiller en viktig rolle opprettholdelsen av normal vev funksjon, dysfunksjonelle ECM har vært innblandet i flere sykdommer2.
Fettvev spiller en viktig rolle i patogenesen av metabolsk sykdom. Fedme er forbundet med overdreven adipocyte hypertrofi og cellulær hypoksi, defekter i adipocyte cellulær metabolisme, og fettvev endoplasmatiske retikulum og oksidativt stress og betennelser. Mens dårlig forstått, disse komplekse prosesser konspirerer å svekke fettvev nærings buffer bufring kapasitet, noe som fører til næringsstoff overflyt fra fettvev, toksisitet i flere vev, og systemisk metabolsk sykdom3,4 ,5. Sekvensen av hendelser og spesifikke mekanismer som ligger til grunn fettvev svikt er dårlig forstått, men endringer i fettvev ECM har vært innblandet. ECM-sammensetningen er endret i fettvev i humant og murine fedme, med økt deponering av ECM-protein sammen med kvalitative biokjemiske og strukturelle forskjeller i fettvev ECM forbundet med menneskelig metabolsk sykdom, inkludert type 2 diabetes og hyperlipidemi6,7,8,9,10,11.
Til tross for disse observasjonene, er rollen av fettvev ECM i formidling fettvev dysfunksjon ikke veldefinert. Dette er delvis på grunn av mangel på medgjørlig eksperimentelle modeller som tillater Disseksjon av de spesifikke rollene til ECM og adipocytter i å regulere ultimate fettvev funksjon. ECM-adipocyte kultur simulerer bedre in vivo miljø av innfødte fettvev i minst to henseender. For det første gir ECM-kulturen et molekyl miljø som ligner på det innfødte fettvevet, inkludert innfødte kollagen, elastins og andre matrise proteiner fraværende i standard 2D-kultur. Dernest har kultur på 2D plast vist å endre adipocyte metabolisme via mekaniske effekter på grunn av redusert elastisitet av plast substrat12, som ECM-kultur eliminerer.
Metoder for å utvikle biologiske stillaser ved isolering av ECM fra decellularized fett og annet vev har blitt studert i sammenheng med regenererende og rekonstruktiv medisin og vev engineering13,14, 15,16,17,18. Vi har tidligere publisert metodikk der vi tilpasset disse metodene for å utvikle en in vitro 3D modell av menneskelig ECM-adipocyte kultur, ved hjelp av ECM og adipocyte stamceller (preadipocytes) avledet fra menneskelige visceral fettvev11. I denne artikkelen beskriver vi disse metodene i detalj. Den decellularization prosedyre for menneskelig fettvev er en fire-dagers prosess som innebærer mekaniske og enzymatisk behandlinger for å fjerne celler og lipid, etterlot seg en biologisk stillas som opprettholder egenskapene til vevet som det er avledet. Decellularized ECM støtter adipogenic differensiering av menneskelig preadipocytes, og når tilberedt med adipocytter, opprettholder mikroarkitektur og biokjemiske og sykdoms-spesifikke karakteristikker av intakt fettvev og engasjerer seg i metabolske funksjoner karakteristisk for innfødte fettvev. Denne matrisen kan bli studert alene eller reseeded med celler, tillater studier av interaksjoner og crosstalk mellom cellulære og ekstracellulære komponenter av fettvev.
Protocol
Representative Results
Discussion
ECM-adipocyte kultur modell gir et verdifullt verktøy for å dissekere de enkelte rollene til ECM og celler i å diktere ultimate vev fenotype. ECM-isolasjons protokollen er ganske reproduserbar, men variasjon i decellularization prosessen kan observeres. Delipidation-trinnet i dag 3 er et kritisk punkt i protokollen. Ved fullføring av overnight utvinning, bør delipidation av matrisen være dokumentert av Polar løsemiddel løsning snu gult, mens matrisen bør overgangen fra en gul-oransje farge karakteristisk for int…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa, og Retha Geiss for assistanse til studie koordinering. SEM ble utført av University of Michigan mikroskopi & Image Analysis laboratorium Biomedical Research Core Facility. Dette prosjektet ble støttet av NIH tilskudd R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), pilot og gjennomførbarhet Grant fra Michigan diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Veteraner administrasjon VISN 10 SPARK pilot Grant (RWO). Scanning elektron mikroskopi utført av University of Michigan mikroskopi & Image Analysis laboratorium Biomedical Research Core Facility. Figur 4 av dette manuskriptet ble opprinnelig publisert i Baker et al., J Clin Endo Metab 2017; 1. mars 102 (3), 1032-1043. Doi: 10.1210/JC. 2016-2915, og har blitt gjengitt med tillatelse fra Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. For tillatelse til å gjenbruke dette materialet, kan du gå http://global.oup.com/academic/rights.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#25200056 | |
| 1.5 mL cryovial tube | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#02-682-557 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#89370-094 | |
| 100 µm nylon mesh filter | Corning Inc., Corning, NY, USA | Cat#352360 | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#D8375 | |
| 2 nM 3,3’-5,Triiodo,L-thyronine sodium salt (T3) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T6397 | |
| 24-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-700 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I5879 | |
| 96-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-666 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#15240062 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#B4639 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#A8806 | |
| Buffer RLT | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#79216 | |
| Ciglitizone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#C3974 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]- | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | Cat#NET328A250UC | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4513 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4902 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP231 | Flammable, caustic |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP118 | |
| D-pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#21210 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#11320033 | |
| Ethanol | Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA | Cat#DSP-MD.43 | Flammable |
| EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#10437028 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#G5882 | Caustic |
| Hexamethyldisalizane | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#440191 | Flammable, caustic |
| Human insulin solution | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I9278 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A415 | Flammable |
| Isoproterenol | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#I5627 | Flammable |
| KCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S25484 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#P5655 | |
| Lipase from porcine pancreas, type VI-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#L0382 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#230391 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#S233 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A661 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK | Cat# AGR1180 | |
| Oil Red-O Solution (ORO) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#O1391 | |
| Oil Red-O Stain Kit | American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA | Cat#KTORO-G | |
| Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#201030 | Caustic |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#93482 | Caustic |
| Phosphate Buffered Saline Solution (PBS) | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SH3025601 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#R5125 | |
| RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#74704 | |
| Scintillation Fluid | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SX18 | |
| Scintillation Counter | |||
| Scissors, forceps, sterile | |||
| Sorensen's phosphate buffer | Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ | CAS #: 10049-21-5 | |
| T-150 culture flask | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10062-864 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#4369016 | |
| Temperature-controlled orbital shaker | |||
| Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer | Benchmark Scientific | Cat#D1030 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T3309 | |
| Triglyceride Determination Kit | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#TR0100 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Type II collagenase | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#17101015 | |
| Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#WHA5201150 |
Riferimenti
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).
- O’Rourke, R. W., Lumeng, C. N. Obesity heats up adipose tissue lymphocytes. Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).
- Engin, A. The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).
- Dankel, S. N., et al. COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size. Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).
- Divoux, A., et al. Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss. Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).
- Lackey, D. E., et al. Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).
- Muir, L. A., et al. Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity. Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).
- Spencer, M., et al. Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).
- Baker, N. A., et al. Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).
- Pellegrinelli, V., et al. Human adipocyte function is impacted by mechanical cues. Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).
- Flynn, L. E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Porzionato, A., et al. Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine. European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).
- Tebyanian, H., et al. A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering. Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
- Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O’Rourke, R. W. Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes. Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).
- O’Rourke, R. W., et al. Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia’s effects on lipid metabolism in human adipocytes. PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Tchoukalova, Y. D., et al. Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans. Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).
