Um modelo de cultura de matriz-adipócito extracelular humano para estudar crosstalk metabólico de matriz e células

Summary

Descrevemos um sistema de cultura in vitro de matriz extracelular em 3D que permite a dissecação dos papéis da matriz e dos adipócitos em contribuir para o fenótipo metabólico do tecido adiposo.

Abstract

A matriz extracelular (ECM) desempenha um papel central na regulação da homeostase dos tecidos, envolvendo-se em crosstalk com as células e regulando múltiplos aspectos da função celular. O ECM desempenha um papel particularmente importante na função do tecido adiposo na obesidade, e alterações na deposição e composição de ECM do tecido adipoto estão associadas à doença metabólica em camundongos e humanos. Modelos in vitro tratáveis que permitem a dissecação dos papéis do ECM e células em contribuir para o fenótipo global de tecidos são escassos. Descrevemos um novo modelo 3D in vitro da cultura humana ECM-adipócito que permite o estudo dos papéis específicos do ECM e adipócitos na regulação do fenótipo metabólico do tecido adiposo. O tecido adiposo humano é decelularizado para isolar o ECM, que é posteriormente repovoado com preadipócitos que são então diferenciados dentro do ECM em adipócitos maduros. Este método cria construções de ECM-adipócitoque são metabolicamente ativas e retêm características dos tecidos e pacientes dos quais são derivados. Usamos este sistema para demonstrar o crosstalk ecm-adipócito específico da doença no tecido adiposo humano. Este modelo de cultura fornece uma ferramenta para dissecar os papéis do ECM e adipócitos em contribuir para o fenótipo metabólico do tecido adiposo global e permite o estudo do papel do ECM na regulação da homeostase do tecido adiposo.

Introduction

A matriz extracelular (ECM) não só fornece um andaime mecânico para os tecidos, mas também se envolve em crosstalk complexo com células que residem dentro dela, regulando diversos processos necessários para a homeostase de tecidos, incluindo a proliferação celular, diferenciação, sinalização e metabolismo^1. Enquanto ECM saudável desempenha um papel essencial na manutenção da função normal do tecido, ECM disfuncional tem sido implicado em múltiplas doenças².

O tecido adiposo desempenha um papel importante na patogênese da doença metabólica. A obesidade está associada à hipertrofia adipócito excessiva e hipóxia celular, defeitos no metabolismo celular adipócito e reticulum endoplasmico do tecido adiposco e estresse oxidativo e inflamação. Embora mal compreendidos, esses processos complexos conspiram para prejudicar a capacidade de amortecimento de nutrientes do tecido adiposo, levando ao transbordamento de nutrientes do tecido adiposo, toxicidade em vários tecidos e doença metabólica sistêmica^{3,4 5.} A seqüência de eventos e mecanismos específicos subjacentes à falha do tecido adiposo são mal compreendidas, mas alterações no tecido adipolado foram implicadas. A composição de ECM é alterada dentro do tecido adiposo na obesidade humana e murina, com maior deposição de proteína ECM, juntamente com diferenças bioquímicas qualitativas e estruturais no tecido adipoado associado à doença metabólica humana, incluindo diabetes tipo 2 e hiperlipidemia^{6,7,8,9,10,11.}

Apesar dessas observações, o papel do tecido adipoto na mediação da disfunção do tecido adiposo não é bem definido. Isto é em parte devido à falta de modelos experimentais tratáveis que permitem a dissecação dos papéis específicos da ECM e adipócitos na regulação da função final do tecido adiposo. A cultura ECM-adipócito simula melhor o ambiente in vivo do tecido adiposo nativo em pelo menos dois aspectos. Em primeiro lugar, a cultura ECM fornece um ambiente molecular semelhante ao tecido adiposo nativo, incluindo collagens nativas, elastinas e outras proteínas matrias ausentes na cultura 2D padrão. Em segundo lugar, a cultura em plástico 2D tem sido mostrado para alterar o metabolismo adipócito através de efeitos mecânicos devido à diminuição da elasticidade do substrato plástico¹², que ECM-cultura elimina.

Métodos para engendrar andaimes biológicos por isolamento de ECM de adiposo descelularizado e outros tecidos têm sido estudados no contexto da medicina regenerativa e reconstrutiva e engenharia de tecidos^{13,14, 15,16,17,18.} Publicamos anteriormente uma metodologia na qual adaptamos esses métodos para desenvolver um modelo 3D in vitro da cultura humana de ECM-adipócito, usando células-tronco ecm e adipócitos (preadipócitos) derivadas de tecidos adiposos viscerais humanos¹¹. No presente artigo, descrevemos esses métodos em detalhes. O procedimento de descelularização para o tecido adiposo humano é um processo de quatro dias que envolve tratamentos mecânicos e enzimáticos para remover células e lipídios, deixando um andaime biológico que mantém características do tecido a partir do qual é derivado. O ECM descelularizado suporta a diferenciação adipogênica de preadipócitos humanos, e quando reconstituído com adipócitos, mantém microarquitetura e características bioquímicas e específicas da doença do tecido adiposo intacto e se envolve em funções características do tecido adiposo nativo. Esta matriz pode ser estudada isoladamente ou resemada com células, permitindo o estudo das interações e a transação cruzada entre os componentes celulares e extracelulares do tecido adiposo.

Protocol

Os tecidos adiposos são adquiridos de seres humanos submetidos a cirurgia bariátrica eletiva aprovação do conselho de revisão institucional. 1. Isolamento preadipocito e preparação de reagente cultural Prepare 2% de albumina séxo bovina (BSA) em solução soro sino-amortecida de fosfato 1x (PBS). Filtrar esterilizar, e armazenar a 4 °C. Prepare a colagem tipo II: 2 mg/mL em 2% BSA em 1x PBS. Prepare-se imediatamente antes de usar. Prepare o Glóbulo Verme…

Representative Results

A preparação do tecido adipolado ECM, a semeade com preadipócitos e a diferenciação in vitro em adipócitos maduros resultam em claras mudanças morfológicas sequenciais no tecido que permitem a avaliação visual do progresso em todo o protocolo (Figura 1) . Preadipocitos usados para semeacar o ECM são isolados usando digestão colagem de amostras separadas de IVA (Figura 2). A microscopia eletrônica de varredura de cons…

Discussion

O modelo de cultura ECM-adipócito fornece uma ferramenta valiosa para dissecar os papéis individuais de ECM e células na dictação fenótipo de tecido final. O protocolo de isolamento de ECM é bastante reproduzível, mas a variabilidade no processo de descelularização pode ser observada. A etapa de delipiação do Dia 3 é um ponto crítico no protocolo. Na conclusão da extração durante a noite, a delipiação da matriz deve ser evidenciada pela Solução de Solvente Polar que fica amarela, enquanto a matriz de…

Materials

0.25% trypsin-EDTA	Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	Cat#25200056
1.5 mL cryovial tube	Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#02-682-557
10% Neutral Buffered Formalin	VWR International LLC., Radnor, PA, USA	Cat#89370-094
100 µm nylon mesh filter	Corning Inc., Corning, NY, USA	Cat#352360
2-Deoxy-D-glucose	Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA	Cat#D8375
2 nM 3,3’-5,Triiodo,L-thyronine sodium salt (T3)	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#T6397
24-well tissue culture plates	VWR International LLC., Radnor, PA, USA	Cat#10861-700
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#I5879
96-well tissue culture plates	VWR International LLC., Radnor, PA, USA	Cat#10861-666
Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM)	Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	Cat#15240062
Biotin	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#B4639
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA	Cat#A8806
Buffer RLT	Qiagen, Hilden, Germany	Cat#79216
Ciglitizone	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#C3974
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]-	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA	Cat#NET328A250UC
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#D4513
Dexamethasone	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#D4902
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#BP231	Flammable, caustic
Disodium EDTA	Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#BP118
D-pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#21210
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12	Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#11320033
Ethanol	Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA	Cat#DSP-MD.43	Flammable
EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek	VWR International LLC., Radnor, PA, USA	Cat#10027-446
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	Cat#10437028
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA	Cat#G5882	Caustic
Hexamethyldisalizane	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#440191	Flammable, caustic
Human insulin solution	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#I9278
Isopropanol	Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#A415	Flammable
Isoproterenol	Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA	Cat#I5627	Flammable
KCl	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#S25484
KH2PO4	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#P5655
Lipase from porcine pancreas, type VI-S	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#L0382
MgSO4*7H2O	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#230391
Na2HPO4	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#S5136
NaCl	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#S3014
NaHCO3	Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#S233
NH4Cl	Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#A661
Optimal cutting temperature (OCT) compound	Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK	Cat# AGR1180
Oil Red-O Solution (ORO)	Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA	Cat#O1391
Oil Red-O Stain Kit	American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA	Cat#KTORO-G
Osmium tetroxide	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#201030	Caustic
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#93482	Caustic
Phosphate Buffered Saline Solution (PBS)	Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#SH3025601
Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#R5125
RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit	Qiagen, Hilden, Germany	Cat#74704
Scintillation Fluid	Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#SX18
Scintillation Counter
Scissors, forceps, sterile
Sorensen's phosphate buffer	Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ	CAS #: 10049-21-5
T-150 culture flask	VWR International LLC., Radnor, PA, USA	Cat#10062-864
TaqMan Gene Expression Master Mix	ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#4369016
Temperature-controlled orbital shaker
Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer	Benchmark Scientific	Cat#D1030
Transferrin	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#T3309
Triglyceride Determination Kit	Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA	Cat#TR0100
Trypan blue stain, 0.4%	VWR International LLC., Radnor, PA, USA	Cat#10027-446
Type II collagenase	Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	Cat#17101015
Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm	Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA	Cat#WHA5201150