Человек 3D Экстраклеточная матрица-Адипоцит Культура Модель для изучения Матрица-Клеточная метаболический перекрестный разговор
Summary
Мы описываем 3D человека внеклеточной матрицы-адипоцитов в пробирке культуры системы, которая позволяет вскрытие ролей матрицы и адипоцитов в содействии жировой ткани метаболического фенотипа.
Abstract
Внеклеточной матрицы (ECM) играет центральную роль в регулировании ткани гомеостаза, участие в перекрестном разговоре с клетками и регулирования нескольких аспектов клеточной функции. ECM играет особенно важную роль в функции жировой ткани при ожирении, а изменения в жировой ткани ECM осаждения и состава связаны с метаболическимзаболеваниеи у мышей и людей. Tractable in vitro модели, которые позволяют вскрытие ролей ECM и клеток в содействии глобальной ткани фенотип редки. Мы описываем новую 3D-модель eCM-адипоцита человека, которая позволяет изучать конкретные роли ECM и адипоцитов в регулировании жировой ткани метаболического фенотипа. Ужировая ткань человека decellularized для того чтобы изолировать ECM, которая затем repopulated с preadipocytes которые после этого продифференцированы внутри ECM в возмужалые адипоциты. Этот метод создает eCM-адипоцитные конструкции, которые метаболически активны и сохраняют характеристики тканей и пациентов, из которых они получены. Мы использовали эту систему, чтобы продемонстрировать специфические заболевания ECM-адипоцита перекрестный стебель в ткани жировой ткани человека. Эта модель культуры обеспечивает инструмент для вскрытия ролей ECM и адипоцитов в содействии глобальной жировой ткани метаболического фенотипа и позволяет изучение роли ECM в регулировании жировой ткани гомеостаза.
Introduction
Внеклеточной матрицы (ECM) не только обеспечивает механические эшафот для тканей, но и участвует в сложных перекрестный разговор с клетками, которые находятся в нем, регулирующие различные процессы, необходимые для ткани гомеостаза, в том числе пролиферации клеток, дифференциации, сигнализации и метаболизма1. В то время как здоровый ECM играет важную роль в поддержании нормальной функции тканей, дисфункциональные ECM был вовлечен в многочисленные заболевания2.
Жировая ткань играет важную роль в патогенезе метаболических заболеваний. Ожирение связано с чрезмерной гипертрофией адипоцитов и клеточной гипоксией, дефектами в адипоцитном клеточном метаболизме, а также эндоплазмическим ретикулумом жировой ткани и окислительным стрессом и воспалением. Хотя плохо понимали, эти сложные процессы в сговоре, чтобы нарушить жировой ткани питательных питательных буферизации потенциала, что приводит к переполнению питательных веществ из жировой ткани, токсичность в нескольких тканях, и системные метаболические заболевания3,4 ,5. Последовательность событий и конкретных механизмов, лежащих в основе жировой ткани неудачи плохо изучены, но изменения в жировой ткани ECM были вовлечены. Состав ECM изменяется в жировой ткани при человеческом и муриновое ожирение, с увеличением осаждения белка ECM наряду с качественными биохимическими и структурными различиями в жировой ткани ECM, связанными с метаболическим заболеванием человека, включая диабет атипа 2 и гиперлипидемия6,7,8,9,10,11.
Несмотря на эти наблюдения, роль жировой ткани ECM в посредничестве жировой дисфункции ткани не четко определена. Отчасти это связано с отсутствием уступчивых экспериментальных моделей, которые позволяют рассеивание конкретных ролей ECM и адипоцитов в регулировании конечной функции жировой ткани. ECM-адипоцитная культура лучше имитирует среду in vivo родной жировой ткани, по крайней мере, в двух отношениях. Во-первых, культура ECM обеспечивает молекулярную среду, похожую на родную жировую ткань, включая местные коллагены, эластины и другие матричные белки, отсутствующие в стандартной 2D-культуре. Во-вторых, культура на 2D пластике, как было показано, изменяет метаболизм адипоцитов с помощью механических эффектов из-за снижения эластичности пластикового субстрата12,который ECM-культура устраняет.
Методы инженера биологических лесов путем изоляции ECM от децеллюлярного жирового и других тканей были изучены в контексте регенеративной и реконструктивной медицины и тканевой инженерии13,14, 15,16,17,18. Мы ранее опубликовали методологию, в которой мы адаптировали эти методы для разработки в пробирке 3D модель человеческой eCM-адипоцитной культуры, используя ECM и адипоцитов стволовых клеток (preadipocytes) полученных из человеческих висцеральных жировые ткани11. В настоящей статье мы подробно описываем эти методы. Процедура децеллюляризации жировой ткани человека представляет собой четырехдневный процесс, который включает в себя механическое и ферментативное лечение для удаления клеток и липидов, оставляя биологические эшафот, который поддерживает характеристики ткани, из которой он получен. Децеллюлярный ECM поддерживает адипогенную дифференциацию проредепоцитов человека, а при восстановлении с помощью адипоцитов поддерживает микроархитектуру и биохимические и болезнеговорящие характеристики нетронутой жировой ткани и участвует в метаболии функции, характерные для родной жировой ткани. Эту матрицу можно изучить самостоятельно или повторно посеять с клетками, что позволяет изучать взаимодействия и перекрестный разговор между клеточными и внеклеточными компонентами жировой ткани.
Protocol
Representative Results
Discussion
Модель культуры ECM-адипоцитов является ценным инструментом для вскрытия отдельных ролей ECM и клеток в диктовке конечной фенотипа ткани. Протокол изоляции ECM довольно воспроизводим, но может наблюдаться изменчивость процесса децеллюляризации. Шаг по делипидуляции дня 3 является критич?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Даниэль Бергер, Мэрилин Вудрафф, Симону Корреа и Рету Гайсс за помощь в координации исследований. SEM была выполнена ВУниверситете Мичигана микроскопии и анализа изображений Лаборатория биомедицинских исследований Основной фонд. Этот проект был поддержан NIH гранты R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Ветераны заслуги Грант I01CX001811 (RWO), пилот и доступность Грант из Мичигана Диабет исследовательский центр (NIH Грант P30-DK020572) (RWO), Администрация ветеранов VISN 10 СПАРК Пилот грант (RWO). Сканирование электронной микроскопии в исполнении Мичиганского университета микроскопии и анализа изображений Лаборатория биомедицинских исследований Основной фонд. Рисунок 4 этой рукописи был первоначально опубликован в журнале Baker et al., J Clin Endo Metab 2017; 1 марта;102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, и был воспроизведен с разрешения издательства Оксфордского университета (https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329). Для получения разрешения на повторное использование этого материала, пожалуйста, посетите http://global.oup.com/academic/rights.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#25200056 | |
| 1.5 mL cryovial tube | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#02-682-557 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#89370-094 | |
| 100 µm nylon mesh filter | Corning Inc., Corning, NY, USA | Cat#352360 | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#D8375 | |
| 2 nM 3,3’-5,Triiodo,L-thyronine sodium salt (T3) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T6397 | |
| 24-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-700 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I5879 | |
| 96-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-666 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#15240062 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#B4639 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#A8806 | |
| Buffer RLT | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#79216 | |
| Ciglitizone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#C3974 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]- | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | Cat#NET328A250UC | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4513 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4902 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP231 | Flammable, caustic |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP118 | |
| D-pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#21210 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#11320033 | |
| Ethanol | Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA | Cat#DSP-MD.43 | Flammable |
| EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#10437028 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#G5882 | Caustic |
| Hexamethyldisalizane | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#440191 | Flammable, caustic |
| Human insulin solution | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I9278 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A415 | Flammable |
| Isoproterenol | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#I5627 | Flammable |
| KCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S25484 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#P5655 | |
| Lipase from porcine pancreas, type VI-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#L0382 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#230391 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#S233 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A661 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK | Cat# AGR1180 | |
| Oil Red-O Solution (ORO) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#O1391 | |
| Oil Red-O Stain Kit | American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA | Cat#KTORO-G | |
| Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#201030 | Caustic |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#93482 | Caustic |
| Phosphate Buffered Saline Solution (PBS) | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SH3025601 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#R5125 | |
| RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#74704 | |
| Scintillation Fluid | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SX18 | |
| Scintillation Counter | |||
| Scissors, forceps, sterile | |||
| Sorensen's phosphate buffer | Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ | CAS #: 10049-21-5 | |
| T-150 culture flask | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10062-864 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#4369016 | |
| Temperature-controlled orbital shaker | |||
| Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer | Benchmark Scientific | Cat#D1030 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T3309 | |
| Triglyceride Determination Kit | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#TR0100 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Type II collagenase | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#17101015 | |
| Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#WHA5201150 |
Riferimenti
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).
- O’Rourke, R. W., Lumeng, C. N. Obesity heats up adipose tissue lymphocytes. Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).
- Engin, A. The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).
- Dankel, S. N., et al. COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size. Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).
- Divoux, A., et al. Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss. Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).
- Lackey, D. E., et al. Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).
- Muir, L. A., et al. Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity. Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).
- Spencer, M., et al. Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).
- Baker, N. A., et al. Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).
- Pellegrinelli, V., et al. Human adipocyte function is impacted by mechanical cues. Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).
- Flynn, L. E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Porzionato, A., et al. Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine. European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).
- Tebyanian, H., et al. A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering. Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
- Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O’Rourke, R. W. Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes. Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).
- O’Rourke, R. W., et al. Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia’s effects on lipid metabolism in human adipocytes. PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Tchoukalova, Y. D., et al. Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans. Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).
