Un modelo de cultivo de matriz-adipocitos extracelulares 3D humano para el estudio de la conversación cruzada metabólica Matrix-Cell
Summary
Describimos un sistema de cultivo in vitro de matriz-adipocitos extracelulares humanos 3D que permite la disección de las funciones de la matriz y los adipocitos en contribuir al fenotipo metabólico del tejido adiposo.
Abstract
La matriz extracelular (ECM) desempeña un papel central en la regulación de la homeostasis tisular, participando en la conversación cruzada con las células y regulando múltiples aspectos de la función celular. El ECM desempeña un papel particularmente importante en la función del tejido adiposo en la obesidad, y las alteraciones en la deposición y composición del ECM del tejido adiposo se asocian con enfermedades metabólicas en ratones y humanos. Los modelos in vitro tractables que permiten la disección de las funciones del ECM y las células para contribuir al fenotipo tisular global son escasos. Describimos un novedoso modelo 3D in vitro del cultivo humano ECM-adipocyte que permite estudiar las funciones específicas del ECM y los adipocitos en la regulación del fenotipo metabólico del tejido adiposo. El tejido adiposo humano se descelulariza para aislar la ECM, que posteriormente se repobla con preadipocitos que luego se diferencian dentro del ECM en adipocitos maduros. Este método crea construcciones ECM-adipocitos que son metabólicamente activas y retienen características de los tejidos y pacientes de los que se derivan. Hemos utilizado este sistema para demostrar la conversación cruzada ECM-adipocyte específica de la enfermedad en el tejido adiposo humano. Este modelo de cultivo proporciona una herramienta para disección de las funciones de la ECM y los adipocitos en la contribución al fenotipo metabólico del tejido adiposo global y permite el estudio del papel del ECM en la regulación de la homeostasis del tejido adiposo.
Introduction
La matriz extracelular (ECM) no sólo proporciona un andamio mecánico para los tejidos, sino que también se involucra en una compleja conversación cruzada con las células que residen dentro de ella, regulando diversos procesos necesarios para la homeostasis tisular, incluida la proliferación celular, diferenciación, señalización y metabolismo1. Mientras que el ECM sano desempeña un papel esencial el mantenimiento de la función normal del tejido, ECM disfuncional se ha implicado en múltiples enfermedades2.
El tejido adiposo desempeña un papel importante en la patogénesis de la enfermedad metabólica. La obesidad se asocia con hipertrofia excesiva de adipocitos e hipoxia celular, defectos en el metabolismo celular de los adipocitos, y el retículo endoplasmático del tejido adiposo y el estrés oxidativo y la inflamación. Si bien no se entienden bien, estos procesos complejos conspiran para afectar la capacidad de amortiguación de nutrientes del tejido adiposo, lo que conduce al desbordamiento de nutrientes del tejido adiposo, toxicidad en múltiples tejidos y enfermedad metabólica sistémica3,4 ,5. La secuencia de eventos y mecanismos específicos que subyacen a la insuficiencia del tejido adiposo se entienden mal, pero se han implicado alteraciones en el tejido adiposo ECM. La composición de ECM se altera dentro del tejido adiposo en la obesidad humana y murina, con una mayor deposición de la proteína ECM junto con diferencias bioquímicas y estructurales cualitativas en el tejido adiposo ECM asociado con la enfermedad metabólica humana, incluyendo diabetes tipo 2 e hiperlipidemia6,7,8,9,10,11.
A pesar de estas observaciones, el papel del ECM del tejido adiposo en la mediación de la disfunción del tejido adiposo no está bien definido. Esto se debe en parte a la falta de modelos experimentales tractables que permiten la disección de las funciones específicas de ECM y adipocitos en la regulación de la función final del tejido adiposo. El cultivo de ECM-adipocyte simula mejor el entorno in vivo del tejido adiposo nativo en al menos dos aspectos. En primer lugar, el cultivo ECM proporciona un entorno molecular similar al tejido adiposo nativo, incluyendo colágenos nativos, elastinas y otras proteínas de matriz ausentes en el cultivo 2D estándar. En segundo lugar, se ha demostrado que el cultivo en plástico 2D altera el metabolismo de los adipocitos a través de efectos mecánicos debido a la disminución de la elasticidad del sustrato plástico12,que elimina el cultivo ECM.
Se han estudiado métodos para diseñar andamios biológicos mediante el aislamiento de ECM de la adiposa descelularizada y otros tejidos en el contexto de la medicina regenerativa y reconstructiva y la ingeniería de tejidos13,14, 15,16,17,18. Hemos publicado previamente una metodología en la que adaptamos estos métodos para desarrollar un modelo 3D in vitro del cultivo humano de ECM-adipocitos, utilizando ECM y células madre de adipocitos (preadipocitos) derivadas de tejidos adiposos viscerales humanos11. En el presente artículo, describimos estos métodos en detalle. El procedimiento de descelularización para el tejido adiposo humano es un proceso de cuatro días que implica tratamientos mecánicos y enzimáticos para eliminar células y lípidos, dejando un andamio biológico que mantiene las características del tejido del que se deriva. El ECM descelularizado apoya la diferenciación adipogénica de los preadipocitos humanos, y cuando se reconstituye con adipocitos, mantiene la microarquitectura y las características bioquímicas y específicas de la enfermedad del tejido adiposo intacto y participa en características del tejido adiposo nativo. Esta matriz se puede estudiar sola o resembrada con células, permitiendo el estudio de interacciones y interrelación entre los componentes celulares y extracelulares del tejido adiposo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El modelo de cultivo de ECM-adipocitos proporciona una herramienta valiosa para disección de las funciones individuales de ECM y células en dictar fenotipo de tejido final. El protocolo de aislamiento ECM es bastante reproducible, pero se puede observar la variabilidad en el proceso de descelularización. El paso de deslipidación del Día 3 es un punto crítico en el protocolo. Al finalizar la extracción durante la noche, la solución de disolvente polar debe evidenciar la deslipidación de la matriz que se vuelve am…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa y Retha Geiss por su ayuda en la coordinación del estudio. SeM fue realizado por University of Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. Este proyecto fue apoyado por niH grants R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), Pilot and Feasibility Grant del Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) Administración de Veteranos VISN 10 SPARK Pilot Grant (RWO). Microscopía electrónica de escaneo realizada por la Universidad de Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. La Figura 4 de este manuscrito fue publicada originalmente en Baker et al., J Clin Endo Metab 2017; Mar 1;102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, y ha sido reproducido con permiso de Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Para obtener permiso para reutilizar este material, visite http://global.oup.com/academic/rights.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#25200056 | |
| 1.5 mL cryovial tube | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#02-682-557 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#89370-094 | |
| 100 µm nylon mesh filter | Corning Inc., Corning, NY, USA | Cat#352360 | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#D8375 | |
| 2 nM 3,3’-5,Triiodo,L-thyronine sodium salt (T3) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T6397 | |
| 24-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-700 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I5879 | |
| 96-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-666 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#15240062 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#B4639 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#A8806 | |
| Buffer RLT | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#79216 | |
| Ciglitizone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#C3974 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]- | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | Cat#NET328A250UC | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4513 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4902 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP231 | Flammable, caustic |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP118 | |
| D-pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#21210 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#11320033 | |
| Ethanol | Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA | Cat#DSP-MD.43 | Flammable |
| EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#10437028 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#G5882 | Caustic |
| Hexamethyldisalizane | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#440191 | Flammable, caustic |
| Human insulin solution | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I9278 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A415 | Flammable |
| Isoproterenol | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#I5627 | Flammable |
| KCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S25484 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#P5655 | |
| Lipase from porcine pancreas, type VI-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#L0382 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#230391 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#S233 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A661 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK | Cat# AGR1180 | |
| Oil Red-O Solution (ORO) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#O1391 | |
| Oil Red-O Stain Kit | American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA | Cat#KTORO-G | |
| Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#201030 | Caustic |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#93482 | Caustic |
| Phosphate Buffered Saline Solution (PBS) | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SH3025601 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#R5125 | |
| RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#74704 | |
| Scintillation Fluid | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SX18 | |
| Scintillation Counter | |||
| Scissors, forceps, sterile | |||
| Sorensen's phosphate buffer | Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ | CAS #: 10049-21-5 | |
| T-150 culture flask | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10062-864 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#4369016 | |
| Temperature-controlled orbital shaker | |||
| Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer | Benchmark Scientific | Cat#D1030 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T3309 | |
| Triglyceride Determination Kit | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#TR0100 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Type II collagenase | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#17101015 | |
| Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#WHA5201150 |
Riferimenti
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).
- O’Rourke, R. W., Lumeng, C. N. Obesity heats up adipose tissue lymphocytes. Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).
- Engin, A. The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).
- Dankel, S. N., et al. COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size. Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).
- Divoux, A., et al. Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss. Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).
- Lackey, D. E., et al. Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).
- Muir, L. A., et al. Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity. Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).
- Spencer, M., et al. Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).
- Baker, N. A., et al. Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).
- Pellegrinelli, V., et al. Human adipocyte function is impacted by mechanical cues. Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).
- Flynn, L. E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Porzionato, A., et al. Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine. European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).
- Tebyanian, H., et al. A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering. Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
- Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O’Rourke, R. W. Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes. Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).
- O’Rourke, R. W., et al. Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia’s effects on lipid metabolism in human adipocytes. PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Tchoukalova, Y. D., et al. Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans. Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).
