Bir İnsan 3D Ekstrasellüler Matrix-Adiposit Kültür Modeli Matrix-Hücre Metabolik Crosstalk Çalışma için
Summary
Biz adipoz doku metabolik fenotip katkıda matris ve adiposit lerin rollerinin diseksiyon sağlayan bir 3D insan ekstrasellüler matriks-adiposit in vitro kültür sistemi açıklar.
Abstract
Hücre dışı matriks (ECM) doku homeostazının düzenlenmesinde, hücrelerle çapraz konuşma yapmada ve hücresel fonksiyonun birden fazla yönünü düzenlemede merkezi bir rol oynar. ECM obezite yağ dokusu fonksiyonu özellikle önemli bir rol oynar, ve yağ dokusu ECM birikimi ve bileşimideğişiklikleri fareler ve insanlarda metabolik hastalık ile ilişkilidir. Küresel doku fenotipkatkıda ECM ve hücrelerin rollerinin diseksiyon izin in vitro modeller seyrek. Biz insan ECM-adiposit kültürünün yeni bir 3D in vitro modeli, adipoz doku metabolik fenotip düzenleyen ECM ve adipositlerin belirli rolleri çalışma izin açıklar. İnsan yağ dokusu ECM izole etmek için desellize edilir, daha sonra olgun adipositler içine ECM içinde ayırt edilir preadipocytes ile yeniden doldurulur. Bu yöntem metabolik olarak aktif olan ve türetildiği doku ve hastaların özelliklerini koruyan ECM-adiposit yapıları oluşturur. Bu sistemi, insan yağ dokusunda hastalığa özgü ECM-adiposit çapraz sapı göstermek için kullandık. Bu kültür modeli küresel yağ dokusu metabolik fenotip katkıda ECM ve adipositlerin rollerini incelemek için bir araç sağlar ve yağ dokusu homeostaz düzenleyen ECM rolünün çalışma izin verir.
Introduction
Hücre dışı matriks (ECM) sadece dokular için mekanik bir iskele sağlar, ama aynı zamanda içinde bulunan hücreler ile karmaşık bir çapraz meşgul, hücre çoğalması da dahil olmak üzere doku homeostaz için gerekli çeşitli süreçleri düzenleyen, farklılaşma, sinyalizasyon ve metabolizma1. Sağlıklı ECM normal doku fonksiyonunun sürdürülmesinde önemli bir rol oynarken, işlevsiz ECM birden fazla hastalığa bürünmemiştir2.
Adipoz doku metabolik hastalığın patogenezinde önemli bir rol oynar. Obezite aşırı adiposit hipertrofisi ve hücresel hipoksi ile ilişkilidir, adiposit hücre metabolizmasında defektler, ve yağ dokusu endoplazmik retikulum ve oksidatif stres ve inflamasyon. Yanlış anlaşılmış olsa da, bu karmaşık süreçler yağ dokusu besin tamponlama kapasitesini bozmak için komplo, yağ dokusundan besin taşması yol açan, birden fazla dokutoksisite, ve sistemik metabolik hastalık3,4 ,5. Yağ dokusu yetmezliğinin altında yatan olaylar dizisi ve belirli mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır, ancak yağ dokusu ECM’deki değişiklikler ecm’ye dahil edilmiştir. ECM bileşimi insan ve mürin obezitesinde yağ dokusu içinde, insan metabolik hastalığı ile ilişkili yağ dokusu ECM nitel biyokimyasal ve yapısal farklılıklar ile birlikte ECM proteininin artmış birikimi ile değiştirilir, dahil olmak üzere tip 2 diyabet ve hiperlipidemi6,7,8,9,10,11.
Bu gözlemlere rağmen, yağ dokusu ECM’nin yağ dokusu disfonksiyonuna aracılık etmedeki rolü iyi tanımlanmamıştır. Bu kısmen nihai yağ dokusu fonksiyonunun düzenlenmesinde ECM ve adipositlerin belirli rollerinin diseksiyonuna izin veren çekilebilir deneysel modellerin eksikliğinden kaynaklanmaktadır. ECM-adiposit kültürü en az iki açıdan yerli yağ dokusunun in vivo ortamını daha iyi simüle eder. İlk olarak, ECM kültürü, standart 2D kültüründe bulunmayan yerli kollajenler, elastinler ve diğer matris proteinleri de dahil olmak üzere yerli yağ dokusuna benzer moleküler bir ortam sağlar. İkinci olarak, 2D plastik kültürü plastik substrat azaltılmış elastikiyeti nedeniyle mekanik etkileri ile adiposit metabolizmasını değiştirmek için gösterilmiştir12, Hangi ECM-kültür ortadan kaldırır.
ECM’nin hücreli yağ ve diğer dokulardan izole edilerek biyolojik iskelelerin tasarlanma yöntemleri rejeneratif ve rekonstrüktif tıp ve doku mühendisliği bağlamında incelenmiştir13,14, 15,16,17,18. Daha önce insan ecm-adiposit kültürünün bir in vitro 3D modeli geliştirmek için bu yöntemleri uyarlanmış metodoloji yayınladık, ECM ve adiposit kök hücreleri kullanarak (preadipocytes) insan visseral yağ dokuları türetilmiştir11. Bu makalede, bu yöntemleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz. İnsan yağ dokusu için decellularization prosedürü, türetildiği dokunun özelliklerini koruyan biyolojik bir iskele bırakarak, hücreleri ve lipid kaldırmak için mekanik ve enzimatik tedaviler içeren dört günlük bir süreçtir. Desellülerce ECM insan pizpositlerinin adipojenik farklılaşmasını destekler ve adipositlerle yeniden oluşturulduğunda, mikromimarisi ve biyokimyasal ve hastalığa özgü sağlam yağ dokusu özelliklerini korur ve metabolik yerli yağ dokusunun karakteristik fonksiyonları. Bu matris tek başına çalışılabilir veya hücrelerle yeniden tohumlanabilir, adipoz dokusunun hücresel ve hücre dışı bileşenleri arasındaki etkileşimlerin ve çapraz konuşmaların incelenmesine izin verilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
ECM-adiposit kültür modeli nihai doku fenotip dikte ECM ve hücrelerin bireysel rolleri diseksiyon için değerli bir araç sağlar. ECM izolasyon protokolü oldukça tekrarlanabilir, ancak hücredışılaştırma sürecinde değişkenlik görülebilir. Gün 3 delipidasyon adımı protokolde kritik bir noktadır. Gece çekimi tamamlandığında, matrisin delipidasyonu Polar Solvent Çözeltisi’nin sarıya dönmesiyle kanıtlanmalıdır, matris ise bozulmamış yağ dokusunun sarı-turuncu renk özelliğinden yarı sayd…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz çalışma koordinasyonu ile yardım için Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa ve Retha Geiss teşekkür ederiz. SEM Michigan Üniversitesi Mikroskopi ve Görüntü Analiz Laboratuvarı Biyomedikal Araştırma Çekirdek Tesisi tarafından gerçekleştirildi. Bu proje NIH hibe R01DK097449 (RWO), R01DK1115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Gaziler İşleri Liyakat Hibe I01CX001811 (RWO), Pilot ve Fizibilite Hibe Michigan Diyabet Araştırma Merkezi (NIH Grant30-DK0205772), RWO (RWO) tarafından desteklenmiştir Gaziler İdaresi VISN 10 SPARK Pilot Grant (RWO). Michigan Üniversitesi Mikroskopi ve Görüntü Analiz Laboratuvarı Biyomedikal Araştırma Çekirdek Tesisi tarafından gerçekleştirilen taramalı elektron mikroskobu. Bu makalenin Şekil 4’ü ilk olarak Baker et al., J Clin Endo Metab 2017’de yayınlanmıştır; Mar 1;102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915 ve Oxford University Press’in izni ile çoğaltıldı [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Bu materyali yeniden kullanmak için lütfen http://global.oup.com/academic/rights ziyaret edin.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#25200056 | |
| 1.5 mL cryovial tube | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#02-682-557 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#89370-094 | |
| 100 µm nylon mesh filter | Corning Inc., Corning, NY, USA | Cat#352360 | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#D8375 | |
| 2 nM 3,3’-5,Triiodo,L-thyronine sodium salt (T3) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T6397 | |
| 24-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-700 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I5879 | |
| 96-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-666 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#15240062 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#B4639 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#A8806 | |
| Buffer RLT | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#79216 | |
| Ciglitizone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#C3974 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]- | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | Cat#NET328A250UC | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4513 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4902 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP231 | Flammable, caustic |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP118 | |
| D-pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#21210 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#11320033 | |
| Ethanol | Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA | Cat#DSP-MD.43 | Flammable |
| EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#10437028 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#G5882 | Caustic |
| Hexamethyldisalizane | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#440191 | Flammable, caustic |
| Human insulin solution | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I9278 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A415 | Flammable |
| Isoproterenol | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#I5627 | Flammable |
| KCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S25484 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#P5655 | |
| Lipase from porcine pancreas, type VI-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#L0382 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#230391 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#S233 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A661 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK | Cat# AGR1180 | |
| Oil Red-O Solution (ORO) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#O1391 | |
| Oil Red-O Stain Kit | American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA | Cat#KTORO-G | |
| Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#201030 | Caustic |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#93482 | Caustic |
| Phosphate Buffered Saline Solution (PBS) | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SH3025601 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#R5125 | |
| RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#74704 | |
| Scintillation Fluid | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SX18 | |
| Scintillation Counter | |||
| Scissors, forceps, sterile | |||
| Sorensen's phosphate buffer | Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ | CAS #: 10049-21-5 | |
| T-150 culture flask | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10062-864 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#4369016 | |
| Temperature-controlled orbital shaker | |||
| Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer | Benchmark Scientific | Cat#D1030 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T3309 | |
| Triglyceride Determination Kit | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#TR0100 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Type II collagenase | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#17101015 | |
| Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#WHA5201150 |
Riferimenti
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).
- O’Rourke, R. W., Lumeng, C. N. Obesity heats up adipose tissue lymphocytes. Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).
- Engin, A. The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).
- Dankel, S. N., et al. COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size. Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).
- Divoux, A., et al. Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss. Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).
- Lackey, D. E., et al. Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).
- Muir, L. A., et al. Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity. Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).
- Spencer, M., et al. Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).
- Baker, N. A., et al. Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).
- Pellegrinelli, V., et al. Human adipocyte function is impacted by mechanical cues. Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).
- Flynn, L. E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Porzionato, A., et al. Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine. European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).
- Tebyanian, H., et al. A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering. Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
- Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O’Rourke, R. W. Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes. Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).
- O’Rourke, R. W., et al. Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia’s effects on lipid metabolism in human adipocytes. PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Tchoukalova, Y. D., et al. Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans. Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).
