Identificação de vias hospedeiras alvo de proteínas efetoras bacterianas usando toxicidade de levedura e telas supressoras
Summary
Patógenos bacterianos secretam proteínas no hospedeiro que têm como alvo processos biológicos cruciais. Identificar as vias hospedeiras alvo de proteínas efeteroras bacterianas é fundamental para abordar a patogênese molecular. Aqui, um método usando um supressor de levedura modificado e tela de toxicidade para elucidar as vias hospedeiras alvo de proteínas efívoras tóxicas é descrito.
Abstract
Bactérias intracelulares secretam fatores de virulência chamados de proteínas efetentes no citosol hospedeiro que agem para subverter as proteínas hospedeiras e/ou suas vias biológicas associadas em benefício da bactéria. A identificação de proteínas de efetoras bacterianas putativas tornou-se mais gerenciável devido aos avanços no sequenciamento do genoma bacteriano e ao advento de algoritmos que permitem a identificação de silicos de genes que codificam candidatos de secreção e/ou eucarióticos Domínios. No entanto, a identificação desses importantes fatores de virulência é apenas um passo inicial. Naturalmente, o objetivo é determinar a função molecular das proteínas efetivas e elucidar como eles interagem com o hospedeiro. Nos últimos anos, técnicas como a tela de dois híbridos de levedura e imunoprecipitações em larga escala, juntamente com espectrometria de massa, ajudaram na identificação de interações proteína-proteína. Embora a identificação de um parceiro de ligação do hospedeiro seja o primeiro passo crucial para elucidar a função molecular de uma proteína efetora bacteriana, às vezes a proteína hospedeira tem múltiplas funções biológicas (por exemplo, actina, clathrina, tubulina) ou a proteína bacteriana não pode ligar fisicamente as proteínas hospedeiras, privando o pesquisador de informações cruciais sobre a via de hospedeiro precisa que está sendo manipulada. Uma tela modificada da toxicidade do fermento acoplada com uma tela do supressor foi adaptada para identificar os caminhos do anfitrião impactados por proteínas bacterianas do efetor. A tela da toxicidade confia em um efeito tóxico no fermento causado pela proteína do efetor que interfere com os caminhos biológicos do anfitrião, que manifesta frequentemente como um defeito do crescimento. A expressão de uma biblioteca genômica de levedura é usada para identificar fatores hospedeiros que suprimem a toxicidade da proteína efetora bacteriana e, assim, identificam proteínas na via que a proteína efetora tem como alvo. Este protocolo contém instruções detalhadas para a toxicidade e telas supressoras. Estas técnicas podem ser realizadas em qualquer laboratório capaz de clonagem molecular e cultivo de levedura e Escherichia coli.
Introduction
O primeiro relato de procedimentos semelhantes aos apresentados aqui caracterizou o efetor SidD, um deAMPylase que modifica Rab11. Técnicas comparáveis foram utilizadas para a caracterização de vários efetores de Pneumofilia L. 1,2,3. O ensaio foi adaptado para caracterizar umaproteínade efeito 4 tipo IV de Coxiella burnetii, e recentemente a utilidade desta técnica foi expandida para a caracterização das proteínas de membrana de inclusão de Clamídia trachomatis 5 .
Este protocolo pode ser dividido em duas partes principais: 1) a tela de toxicidade de levedura, em que a proteína efetora bacteriana de interesse é expressa em levedura e clones são rastreados para um fenótipo tóxico, como evidenciado por um defeito de crescimento, e 2) a tela supressor a levedura , em que o fenótipo tóxico é suprimido pela expressão de uma biblioteca genômica de levedura na cepa tóxica. Assim, a tela de toxicidade é uma tela para fenótipos tóxicos que se manifestam como defeitos de crescimento quando o efetor bacteriano de interesse é superexpresso. Clones tóxicos, transformados com sucesso e expressando o efetor bacteriano, são selecionados e guardados para o próximo passo. O segundo grande passo envolve a superexpressão de uma biblioteca genômica de levedura parcialmente digerida no clone tóxico de levedura. Plasmids que compõem a biblioteca genômica de levedura sugerida para o uso neste protocolo carregam inserções de 5 a 20 kb, geralmente correspondentes a quadros de leitura abertos de levedura de 3 a 13 (ORF) de um tamanho genético médio de ~1,5 kb em todos os plasmídeos, representando todo o genoma do fermento coberto aproximadamente 10x. Esta parte do ensaio é chamada a tela do supressor, porque o objetivo é suprimir a toxicidade da proteína bacteriana do efetor. Os plasmídeos potenciais do supressor são isolados do fermento, sequenciados, e dos ORFs de supressão identificados. A lógica subjacente à tela supressora é que a proteína efetora se liga, interage com, e /ou sobrecarrega componentes da via hospedeira que visa, e que fornecer essas proteínas hospedeiras de volta em excesso pode resgatar o efeito tóxico na via e, portanto, o defeito de crescimento. Assim, orfs identificados que suprimem a toxicidade muitas vezes representam vários participantes de uma via de acolhimento. Experimentos ortogonais são então realizados para verificar se o efetor bacteriano interage com a via implicada. Isto é especialmente necessário se um parceiro vinculativo, como clathrin ou actina foi identificado, porque essas proteínas estão envolvidas em uma infinidade de processos hospedeiros. Outras experiências podem então elucidar a função fisiológica da proteína efetiva durante a infecção. As telas de toxicidade e supressortambém são ferramentas poderosas para decifrar a função fisiológica de proteínas efetoras bacterianas que não ligam fisicamente proteínas hospedeiras com afinidades suficientes para detectar por imunoprecipitação ou que interagem com o host em interações enzimáticas hit-and-run que não podem ser detectadas por uma tela híbrida de levedura dois.
Embora a tela supressora possa ser um método poderoso para revelar potenciais interações fisiológicas entre proteínas efetoras bacterianas e vias hospedeiras, a proteína efetora bacteriana deve induzir um defeito de crescimento na levedura, caso contrário, usá-lo no tela supressor será de pouca utilidade. Além disso, o fenótipo tóxico deve resultar em pelo menos um déficit de crescimento de 2 a 3 log10 ou será difícil identificar supressores. Se um laboratório é criado para a cultura celular, proteínas efecionistas de triagem para toxicidade em linhas celulares comuns, como HeLa, muitas vezes pode dar uma visão sobre se vale a pena o esforço para prosseguir com a tela de toxicidade de levedura. Expressão ectópica da proteína efetora nas células HeLa, por vezes, resulta em toxicidade que se correlaciona muito fortemente com a toxicidade na cepa de levedura usada para estas telas4. Características observáveis de estresse nas células HeLa incluem perda de fibras de estresse, desprendimento celular da placa e condensação nuclear indicando apoptose. Qualquer indicação visual de estresse nas células HeLa tornar a proteína de interesse um bom candidato para induzir um defeito de crescimento na levedura, que se replicam muito mais rapidamente e são, portanto, mais sensíveis à perturbação de vias essenciais.
Note-se que a tela supressora nem sempre identifica parceiros de ligação do hospedeiro como supressores, mas ainda pode implicar componentes críticos da via de hospedeiro (s) direcionada, produzindo uma visão holística dos processos biológicos que estão sendo sequestrados proteína efetora bacteriana. Na superfície, isso parece contraintuitivo, porque fornecer o parceiro de ligação da proteína efetiva em excesso seria esperado para resgatar o defeito de crescimento. Nos esforços para identificar caminhos visados pela proteína c. trachomatis efetivo CT229 (CpoS), que se liga a pelo menos 10 diferentes Rab GTPases durante a infecção5, nenhum dos parceiros de ligação Rab suprimiu a toxicidade do CT229. No entanto, foram identificados numerosos supressores envolvidos no tráfico de vesículas revestidas de clathrin (CCV), o que levou a um trabalho adicional demonstrando que o CT229 subverte especificamente o tráfico de CCV dependente da Rab. Da mesma forma, ao investigar a proteína efetora C. burnetii Cbu0041 (CirA) vários Rho GTPases que resgataram o defeito de crescimento da levedura foram identificados, e mais tarde descobriu-se que a CirA funciona como uma proteína ativadora de GTPase (GAP) para RhoA4.
A utilidade da tela supressora de levedura para elucidar as vias hospedeiras alvo de proteínas efívoras não pode ser exagerada, e outros pesquisadores que tentam caracterizar proteínas efívoras intracelulares podem se beneficiar muito estas técnicas. Estes ensaios são de valor se as imunoprecipitações e/ou telas híbridas de levedura dois não conseguiram encontrar um parceiro vinculativo e podem elucidar quais as vias que são alvo da proteína efetora bacteriana. Aqui, protocolos detalhados para a toxicidade e telas supressoras para identificar as vias biológicas do hospedeiro alvo de proteínas efetoras bacterianas intracelulares são fornecidos, bem como alguns dos obstáculos comuns experimentados ao usar esses ensaios e seus soluções correspondentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve procedimentos passo a passo para identificar vias biológicas do hospedeiro alvo de proteínas efívoras usando uma toxicidade de levedura modificada e tela supressora. A cepa de levedura utilizada, S. cerevisiae W303, é auxotrófica tanto para uracil quanto para a leucina. A auxofia uracil da cepa é usada para selecionar levedura carregando a proteína de interesse no vetor pYesNTA-Kan, enquanto a auxofia leucine é usada para selecionar para o vetor de biblioteca genômica de levedura…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Shelby Andersen, Abby McCullough, e Laurel Woods por sua ajuda com essas técnicas. Este estudo foi financiado por fundos de inicialização do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Universidade de Iowa para Mary M. Weber.
Materials
| Agar | Fisher Scientific | BP2641500 | |
| Galactose | MilliporeSigma | G0750-1KG | |
| GeneJet Gel extraction kit | ThermoFisher Scientific | K0691 | |
| GeneJet PCR purification kit | ThermoFisher Scientific | K0701 | |
| GeneJet plasmid miniprep kit | Thermo | K0503 | |
| Glucose | MilliporeSigma | G8270-1KG | |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1811 | |
| KpnI-HF | New England Biolabs | R3142S | |
| Lithium acetate dihydrate | MilliporeSigma | L6883-250G | |
| Peptone | Fisher Scientific | ||
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(ethylene glycol) 3350 | MilliporeSigma | 1546547-1G | |
| pYep13 | ATCC | 37323 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Tryptophan | MilliporeSigma | 470031-1G | |
| XhoI-HF | New England Biolabs | R0146S | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Yeast miniprep kit | Zymo | D2001 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | MilliporeSigma | Y0626-250G | |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1501-20G | without uracil |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1771-20G | without uracil, leucine, tryptophan |
Riferimenti
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