Идентификация хост Пути целевых бактериальных протеинов с использованием дрожжей токсичности и супрессорэкранов
Summary
Бактериальные патогены выделяют белки в хост, которые нацелены на важнейшие биологические процессы. Выявление путей пребывания, мишенью для белков бактериальных эффекторов является ключом к решению молекулярного патогенеза. Здесь описан метод с использованием модифицированного супрессора дрожжей и экрана токсичности для выяснения путей пребывания, мишенью которыми становятся токсичные бактериальные протеины.
Abstract
Внутриклеточные бактерии выделяют вирулентные факторы, называемые эффекторными белками в цитозол хозяина, которые действуют, чтобы подорвать белки-хозяева и/или связанные с ними биологические пути в пользу бактерии. Идентификация допустимых бактериальных эффекторов белков стала более управляемой благодаря достижениям в секвенировании бактериального генома и появлению алгоритмов, которые позволяют в силико-идентификации генов, кодирующих секрецию кандидатов и/или эукариотических Доменов. Однако выявление этих важных факторов вирулентности является лишь первым шагом. Естественно, цель состоит в том, чтобы определить молекулярную функцию эффекторов белков и выяснить, как они взаимодействуют с хозяином. В последние годы такие методы, как дрожжи двухгибридного экрана и крупномасштабных иммунопрециций в сочетании с масс-спектрометрии помогли в выявлении белково-белковых взаимодействий. Хотя идентификация партнера, связывающего хозяина, является важнейшим первым шагом на пути к выяснению молекулярной функции белка бактериального эффектора, иногда протеин-хозяин имеет несколько биологических функций (например, актин, клатрин, тубулин) или бактериальный белок не может физически связывать белки-хозяева, лишая исследователя важной информации о точном пути пребывания, которым манипулируют. Модифицированный экран токсичности дрожжей в сочетании с экраном супрессора был адаптирован для идентификации путей пребывания, пострадавших от белков бактериальных эффекторов. Экран токсичности опирается на токсическое воздействие на дрожжи, вызванное эффектор белка вмешательства в принимающей биологических путей, который часто проявляется как дефект роста. Выражение дрожжевой геномной библиотеки используется для выявления факторов, которые подавляют токсичность белка бактериального эффектора и таким образом определить белки в пути, что эффектор белка цели. Этот протокол содержит подробные инструкции как для токсичности, так и для экранов супрессора. Эти методы могут быть выполнены в любой лаборатории, способной молекулярного клонирования и выращивания дрожжей и кишечной палочки.
Introduction
Первый доклад процедур, аналогичных тем, которые представлены здесь характеризуется Legionella пневмофилы типа IV эффектор СидД, deAMPylase, который изменяет Rab11. Сопоставимые методы были использованы для характеристики нескольких L. пневмофила эффекторов1,2,3. Анализ был адаптирован для характеристики Coxiella burnetii типа IV эффектор белка4, и в последнее время полезность этой техники была расширена для характеристики Chlamydia trachomatis включения мембранных белков5 .
Этот протокол может быть разбит на две основные части: 1) экран токсичности дрожжей, в котором бактериальный белок, представляющий интерес, выражается в дрожжах, а клоны проверяются на токсичный фенотип, о чем свидетельствует дефект роста, и 2) экран супрессора дрожжей , в котором токсичный фенотип подавляется выражением дрожжевой геномной библиотеки в токсичном штамме. Таким образом, экран токсичности является экраном для токсичных фенотипов, которые проявляются как дефекты роста, когда бактериальный эффект интереса является переэкспрессива. Токсичные клоны, успешно трансформированные с помощью бактериального эффектора и выражающие бактериальный эффектор, отбираются и сохраняются для следующего шага. Второй важный шаг включает в себя переэкспрессирование частично переваренных дрожжей геномной библиотеки в токсичных клон дрожжей. Плазмиды, составляющие дрожжевой геномной библиотеки, предложенные для использования в этом протоколе нести 5’20 кб вставки, как правило, соответствующие 3’13 дрожжей открытых кадров чтения (ORF) среднего размера гена 1,5 кб во всех плазмидах, представляющих весь геном дрожжей покрыты примерно в 10 раз. Эта часть ассея называется экраном супрессора, так как цель состоит в том, чтобы подавить токсичность белка бактериального эффектора. Потенциальные супрессорные плазмиды изолированы от дрожжей, секвенируются, и подавления ORFs определены. Обоснование, лежащее в основе экрана супрессора, состоит в том, что протеин-эффектор связывается, взаимодействует с и/или переполняет компоненты пути пребывания, на которые он нацелен, и что предоставление этих белков-хозяев в избытке может спасти токсическое воздействие на пути и, таким образом, дефект роста. Таким образом, выявленные ORF, подавляющие токсичность, часто представляют несколько участников пути хоста. Ортогоналальные эксперименты затем выполняются для проверки того, что бактериальный эффектор действительно взаимодействует с вовлеченным пути. Это особенно необходимо, если связывающий партнер, такой как клатрин или актин, был выявлен, потому что эти белки участвуют во множестве принимающих процессов. Дальнейшие эксперименты могут затем выяснить физиологическую функцию белка-эффектора во время инфекции. Токсичность и супрессор экраны также мощные инструменты для расшифровки физиологической функции бактериальных белков, которые физически не связывают белки-хозяева с сродствами, достаточными для обнаружения иммунопрецицией или которые взаимодействуют с хост в ферментативных хит-и-запустить взаимодействия, которые не могут быть обнаружены дрожжи-два гибридного экрана.
Хотя экран супрессора может быть мощным методом, чтобы выявить потенциальные физиологические взаимодействия между бактериальными белками-эффекторами и путями хозяина, бактериальный белок должен вызвать дефект роста в дрожжах, в противном случае используя его в экран супрессора будет мало пользы. Кроме того, токсичный фенотип должен привести, по крайней мере, к дефициту роста в 2х3 журнала10, иначе будет трудно определить супрессоры. Если лаборатория создана для клеточной культуры, скрининг эффектор белков для токсичности в общих клеточных линий, таких как HeLa часто может дать представление о том, стоит ли усилия, чтобы приступить к экрану токсичности дрожжей. Эктопическое выражение белка-эффектора в клетках HeLa иногда приводит к токсичности, которая очень сильно коррелирует с токсичностью в штамме дрожжей, используемом для этих экранов4. Наблюдаемые признаки стресса в клетках HeLa включают потерю стрессовых волокон, отслоение клеток от пластины и ядерный конденсацию, указывающий на апоптоз. Любое визуальное указание стресса в клетках HeLa делает интересующий белок хорошим кандидатом для индуцирования дефекта роста в дрожжах, которые размножаются гораздо быстрее и, таким образом, более чутко реагируют на возмущение основных путей.
Следует отметить, что экран супрессора не всегда определяет партнеров-хоста, связывающих сяпок, как супрессоров, но он все еще может вовлечь критические компоненты пути хоста (ы) целевых, что дает целостное представление о биологических процессах, захваченных бактериальный эффектор белка. На первый взгляд, это кажется нелогичным, потому что предоставление связующего партнера протеина-эффектора в избытке, как ожидается, спасет дефект роста. В усилиях по выявлению путей, направленных на C. trachomatis эффектор белка CT229 (CpoS), который связывается с по крайней мере 10 различных Rab GTPases во время инфекции5, ни один из Раб связывания партнеров подавлены токсичности CT229. Тем не менее, были выявлены многочисленные супрессоры, занимающиеся торговлей везикулами с покрытием clathrin (CCV), что привело к дальнейшей работе, продемонстрировавшей, что CT229 специально подрывает торговлю ХКВ, зависящим от раба. Аналогичным образом, при исследовании C. burnetii эффектор белка Cbu0041 (CirA) несколько Rho GTPases, которые спасли дефект роста дрожжей были выявлены, и позже было установлено, что CirA функции в качестве GTPase активации белка (GAP) для RhoA4.
Полезность экрана супрессора дрожжей для выяснения путей хозяина, мишенью которыми становятся бактериальные эффекторные белки, не может быть переоценена, и другие исследователи, пытающиеся охарактеризовать внутриклеточные бактериальные эффекторные белки, могут извлечь большую пользу из эти методы. Эти анализы имеют значение, если иммунопрецитарии и / или дрожжей два гибридных экранов не смогли найти связующего партнера и может выяснить, какие пути ориентированы на бактериальный эффектор белка. Здесь предоставляются подробные протоколы для токсичности и супрессоров для определения биологических путей пребывания, нацеленных на внутриклеточные бактериальные эффекторные белки, а также некоторые из распространенных препятствий, испытываемых при использовании этих анализов и их соответствующих решений.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе излагаются пошаговые процедуры для определения биологических путей пребывания, нацеленных на бактериальные эффекторные белки с использованием модифицированной токсичности дрожжей и экрана супрессоров. Дрожжи штамм используется, S. cerevisiae W303, auxotrophic для обоих uracil …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Шелби Андерсен, Эбби Маккалоу и Лорел Вудс за помощь в этих методах. Это исследование было профинансировано за счет стартап-фондов от Университета Айовы Департамента микробиологии и иммунологии мэри М. Вебер.
Materials
| Agar | Fisher Scientific | BP2641500 | |
| Galactose | MilliporeSigma | G0750-1KG | |
| GeneJet Gel extraction kit | ThermoFisher Scientific | K0691 | |
| GeneJet PCR purification kit | ThermoFisher Scientific | K0701 | |
| GeneJet plasmid miniprep kit | Thermo | K0503 | |
| Glucose | MilliporeSigma | G8270-1KG | |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1811 | |
| KpnI-HF | New England Biolabs | R3142S | |
| Lithium acetate dihydrate | MilliporeSigma | L6883-250G | |
| Peptone | Fisher Scientific | ||
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(ethylene glycol) 3350 | MilliporeSigma | 1546547-1G | |
| pYep13 | ATCC | 37323 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Tryptophan | MilliporeSigma | 470031-1G | |
| XhoI-HF | New England Biolabs | R0146S | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Yeast miniprep kit | Zymo | D2001 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | MilliporeSigma | Y0626-250G | |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1501-20G | without uracil |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1771-20G | without uracil, leucine, tryptophan |
Riferimenti
- Tan, Y., Luo, Z. Q. Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1. Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).
- Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization. Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).
- Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -. Q. Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).
- Weber, M. M., et al. The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection. Infection and Immunity. 84, (2016).
- Faris, R., et al. Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection. Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).
- Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156, 119 (1995).
- Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070 (1991).
- Kramer, R. W., et al. Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation. PLoS Pathogens. 3 (2), 21 (2007).
- Häuser, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).
- Mirrashidi, K. M., et al. Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection. Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).
- Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7 (1), 1-9 (2016).
- Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron. PLoS ONE. 8 (12), 83989 (2013).
- Weber, M. M., et al. Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death. Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).
- Weber, M. M., et al. A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion. Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).
