Identifiering av värdvägar riktade av bakteriella Effektorproteiner med hjälp av jäst toxicitet och suppressor skärmar
Summary
Bakteriella patogener utsöndrar proteiner till värden som riktar avgörande biologiska processer. Att identifiera de värdvägar som är riktade mot bakteriella effektorproteiner är nyckeln till att ta itu med molekylär patogenes. Här, en metod med hjälp av en modifierad jäst suppressor och toxicitet skärmen för att belysa värdvägar riktade av giftiga bakteriella effektor proteiner beskrivs.
Abstract
Intracellulära bakterier utsöndrar virulensfaktorer som kallas effektorproteiner i den mottagande cytosolen som agerar för att undergräva värd proteiner och/eller deras associerade biologiska vägar till nytta för bakterien. Identifiering av förruttande bakteriella effektorproteiner har blivit mer hanterbar på grund av framsteg i bakteriell genom sekvensering och tillkomsten av algoritmer som möjliggör i silico identifiering av gener som kodar sekretion kandidater och/eller eukaryota-liknande Domäner. Identifieringen av dessa viktiga virulensfaktorer är dock bara ett första steg. Målet är naturligtvis att bestämma den molekylära funktionen hos effektorproteiner och belysa hur de interagerar med värden. Under de senaste åren, tekniker som jästen två-hybrid skärm och storskaliga immunoprecipitations tillsammans med masspektrometri har hjälpt till att identifiera protein-protein interaktioner. Även om identifieringen av en värd bindnings partner är det avgörande första steget mot att belysa den molekylära funktionen hos ett bakteriellt effektorprotein, finns ibland värd proteinet som har flera biologiska funktioner (t. ex. Actin, clathrin, tubulin) eller bakterie proteinet kanske inte fysiskt binder värd proteiner och berövar forskaren viktig information om den exakta värdvägen som manipuleras. En modifierad jästtoxicitetsskärm i kombination med en suppressor-skärm har anpassats för att identifiera värdvägar som påverkas av bakteriella effektorproteiner. Toxiciteten skärmen förlitar sig på en toxisk effekt i jäst orsakad av effektor proteinet stör värd biologiska vägar, som ofta manifesteras som ett tillväxtfel. Uttryck för en jäst genomiskt bibliotek används för att identifiera värd faktorer som hämmar toxiciteten av bakteriefakterictor protein och därmed identifiera proteiner i den väg som effektor protein mål. Detta protokoll innehåller detaljerade instruktioner för både toxicitet och suppressor skärmar. Dessa tekniker kan utföras i alla laboratorier som kan molekylär kloning och odling av jäst och Escherichia coli.
Introduction
Den första rapporten av förfaranden som liknar dem som presenteras här kännetecknas Legionella pneumophila typ IV effektor sidd, en deAMPylase som modifierar Rab11. Jämförbara tekniker användes för karakteriseringen av flera L. pneumophila effektorer1,2,3. Analysen var anpassad för att karakterisera en Coxiella burnetii typ IV effektor protein4, och nyligen nyttan av denna teknik utökades för karakterisering av klamydia trachomatis integration membranproteiner5 .
Detta protokoll kan delas in i två huvuddelar: 1) den jästtoxicitet skärmen, där bakterieeffektorprotein av intresse uttrycks i jäst och kloner screenas för en toxisk fenotyp som framgår av en tillväxtfel, och 2) jästen suppressor skärmen , där den toxiska fenotypen dämpas genom uttryck av ett jästgenomiskt bibliotek i den giftiga stammen. Således är toxiciteten skärmen en skärm för giftiga fenotyper som manifesteras som tillväxtdefekter när bakteriell effektor av intresse är överuttryckt. Giftiga kloner, framgångsrikt omvandlas med och uttrycker bakteriell effektor, väljs och sparas för nästa steg. Det andra stora steget innebär att överuttrycka en delvis smält jäst genomiskt bibliotek i giftiga jästklon. Plasmider som utgör jäst genomiskt bibliotek föreslås för användning i detta protokoll bära 5 − 20 KB skär, vanligen motsvarande 3 − 13 jäst öppen läsning ramar (ORF) av en genomsnittlig gen storlek ~ 1,5 KB över alla plasmider, som representerar hela jästgenomet täckt cirka 10X. Denna del av analysen kallas suppressor skärmen, eftersom målet är att undertrycka toxiciteten av bakterieeffektorproteinet. Potentiella suppressor plasmider är isolerade från jäst, sekvenserade, och undertrycka ORFs identifierats. Den logiska grunden bakom suppressor skärmen är att effektor proteinet binder, interagerar med, och/eller övervältar delar av värdvägen den mål, och att ge dessa värd proteiner tillbaka i överskott kan rädda den toxiska effekten på vägen och därmed, tillväxten defekt. Således identifierade ORFs som hämmar toxicitet ofta representerar flera deltagare i en värd väg. Ortogonala experiment utförs sedan för att kontrollera att bakterien effektor faktiskt interagerar med den inblandade vägen. Detta är särskilt nödvändigt om en bindande partner som proteinet eller aktin har identifierats, eftersom dessa proteiner är involverade i en mängd värdprocesser. Ytterligare experiment kan sedan belysa den fysiologiska funktionen av effektorproteinet under infektion. Toxiciteten och suppressor skärmarna är också kraftfulla verktyg för att dechiffrera den fysiologiska funktionen av bakteriella effektorproteiner som inte fysiskt binder värd proteiner med affiniteter som är tillräckliga för att detektera genom immunoprecipitation eller som interagerar med värd i enzymatiska hit-and-Run interaktioner som inte kan upptäckas av en jäst-två hybrid skärm.
Även om suppressor skärmen kan vara en kraftfull metod för att avslöja potentiella fysiologiska interaktioner mellan bakteriella effektorproteiner och värdvägar, bakterie effektor proteinet måste inducera en tillväxtfel i jäst, annars använder den i suppressor skärmen kommer att vara till föga nytta. Dessutom måste den toxiska fenotypen resultera i minst en 2 − 3 log10 underskott i tillväxt eller det kommer att bli svårt att identifiera suppressorer. Om ett laboratorium är inrättat för cellkultur, screening effektor proteiner för toxicitet i gemensamma cellinjer såsom HeLa kan ofta ge insikt om huruvida det är värt ansträngningen att gå vidare med jästtoxicitet skärmen. Ektopisk uttryck för effektorproteinet i HeLa celler resulterar ibland i toxicitet som korrelerar mycket starkt med toxicitet i jäststammen som används för dessa skärmar4. Observerbara kännetecken av stress i HeLa celler inkluderar förlust av stress fibrer, cell avlossning från plattan, och nukleär kondensation indikerar apoptos. Varje visuell indikation av stress i HeLa celler gör proteinet av intresse en bra kandidat för att framkalla en tillväxtfel i jäst, som replikerar mycket snabbare och är därmed mer lyhörd för störning av viktiga vägar.
Det bör noteras att den suppressor skärmen inte alltid identifiera värd bindande partner som dämpning, men det kan fortfarande inblandade kritiska komponenter i värdvägen (er) riktade, vilket ger en helhetsbild av de biologiska processer som kapas av bakterie effektor protein. På ytan, detta verkar kontraintuitivt, eftersom att ge bindande partner av effektor protein i överskott skulle kunna förväntas rädda tillväxtdefekten. I arbetet med att identifiera vägar riktade av C. trachomatis effektor protein CT229 (cpos), som binder till minst 10 olika Rab gtpases under infektion5, ingen av Rab bindande partners undertryckt toxiciteten av CT229. Men många suppressorer inblandade i clathrin-belagda vesikel (CCV) människohandel identifierades, vilket ledde till ytterligare arbete visar att CT229 specifikt underminerar Rab-beroende CCV trafficking. Likaså, vid utredning av C. burnetii effektor protein Cbu0041 (CIRA) flera Rho gtpases som räddade jästen tillväxtfel identifierades, och det konstaterades senare att CIRA fungerar som en gtpase aktivera protein (Gap) för RhoA4.
Nyttan av jäst suppressor skärmen för att belysa värdvägar riktade av bakteriella effektorproteiner kan inte överskattas, och andra forskare som försöker karakterisera intracellulära bakteriella effektorproteiner kan i hög grad dra nytta av dessa tekniker. Dessa analyser är av värde om immunoprecipitations och/eller jäst-två hybrid skärmar har misslyckats med att hitta en bindande partner och kan belysa vilka vägar som är riktade av bakterieeffektorproteinet. Här, detaljerade protokoll för toxicitet och suppressor skärmar för att identifiera värd biologiska vägar riktade av intracellulära bakteriella effektor proteiner tillhandahålls, liksom några av de gemensamma hinder som upplevs när du använder dessa analyser och deras motsvarande lösningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver steg-för-steg-procedurer för att identifiera värd biologiska vägar riktade av bakteriella effektorproteiner med hjälp av en modifierad jäst toxicitet och suppressor skärm. Den jäst stam som används, S. cerevisiae W303, är auxotrophic för både uracil och leucin. Uracil auxotrophy av stammen används för att välja jäst transporterar protein av intresse på pyesnta-kan vektor medan leucin auxotrophy används för att välja för jästen genomisk Library Vector pYep13. Jäste…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Shelby Andersen, Abby McCullough och Laurel Woods för deras hjälp med dessa tekniker. Denna studie finansierades av startup medel från University of Iowa Institutionen för mikrobiologi och immunologi till Mary M. Weber.
Materials
| Agar | Fisher Scientific | BP2641500 | |
| Galactose | MilliporeSigma | G0750-1KG | |
| GeneJet Gel extraction kit | ThermoFisher Scientific | K0691 | |
| GeneJet PCR purification kit | ThermoFisher Scientific | K0701 | |
| GeneJet plasmid miniprep kit | Thermo | K0503 | |
| Glucose | MilliporeSigma | G8270-1KG | |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1811 | |
| KpnI-HF | New England Biolabs | R3142S | |
| Lithium acetate dihydrate | MilliporeSigma | L6883-250G | |
| Peptone | Fisher Scientific | ||
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(ethylene glycol) 3350 | MilliporeSigma | 1546547-1G | |
| pYep13 | ATCC | 37323 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Tryptophan | MilliporeSigma | 470031-1G | |
| XhoI-HF | New England Biolabs | R0146S | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Yeast miniprep kit | Zymo | D2001 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | MilliporeSigma | Y0626-250G | |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1501-20G | without uracil |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1771-20G | without uracil, leucine, tryptophan |
Riferimenti
- Tan, Y., Luo, Z. Q. Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1. Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).
- Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization. Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).
- Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -. Q. Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).
- Weber, M. M., et al. The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection. Infection and Immunity. 84, (2016).
- Faris, R., et al. Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection. Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).
- Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156, 119 (1995).
- Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070 (1991).
- Kramer, R. W., et al. Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation. PLoS Pathogens. 3 (2), 21 (2007).
- Häuser, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).
- Mirrashidi, K. M., et al. Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection. Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).
- Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7 (1), 1-9 (2016).
- Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron. PLoS ONE. 8 (12), 83989 (2013).
- Weber, M. M., et al. Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death. Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).
- Weber, M. M., et al. A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion. Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).
