אלקטרונואידים מבוססי מיקרופלואידיג דיגיטלי היא טכניקה העושה שינוי מונחה מתח בזווית המגע לכאורה של droplet מיקרוליטר-נפח כדי להקל על המניפולציה שלה. שילוב זה עם חרוזים מגנטיים פונקציונליזציה מאפשר שילוב של מספר מבצעים ביחידת מעבדה עבור הכנה לדוגמה וזיהוי של פתוגנים באמצעות חיסוני מקושר אנזים (אליסה).
המתח האלקטלי הוא האפקט שעליו משתנה זווית יצירת הקשר של droplet החשופה למטען משטח. אלקטרו-בידוד (EWOD) מנצלת את התכונות הדיאלקטרי של סרטים בידוד דק כדי לשפר את צפיפות המטען ומכאן להגביר את ההשפעה החשמלית. הנוכחות של חיובים מביא התפשטות חשמלית המושרה של droplet המאפשר מניפולציה תכליתי על פני משטח הידרופובי. כאן, אנו מדגימים פרוטוקול EWOD מבוסס על עיבוד לדוגמה וזיהוי של ארבע קטגוריות של אנטיגנים, באמצעות פלטפורמת הגשמה אוטומטית משטח, באמצעות שתי וריאציות של שיטות חיסוני מקושרים אנזים (אליסה). אליסה מבוצעת על חרוזים מגנטיים עם מקיבוע נוגדנים ראשוניים אשר ניתן לבחור כדי למקד אנטיגן ספציפי. נוגדן מצומת HRP נקשר האנטיגן מעורבב עם H2O2/לומינול עבור קוונפיקציה של פתוגנים שנתפסו. שעות השלמת המילוי של בין 6 ו -10 דקות הושגו, בעוד כמויות זעיר של ריאגנטים היו מנוצלים.
השיטה המוצעת שואפת להקל על הכנה לדוגמה אוטומטית עבור אליסה עם זיהוי כמותי של אנטיגנים באמצעות הגישה EWOD מבוססי עם מיקרופלואידיקה דיגיטלי (DMF) ו הפרדה magnetop,. זה הוכח עבור יישומים ביולוגיים מרובים כי DMF בשילוב עם magnetophoresis היא חלופה מעניינת יישומים טיפול נוזלי1. ליתר דיוק, גילוי פתוגנים הוא היבט משתמע במגזרים רבים, החל בריאות2 לחקלאות וסביבה3,4 לביטחון הלאומי5. טכנולוגיית הזיהוי המסוגלת לטפל באיומים מפני פתוגנים חייבים לכלול תפוקה גבוהה (למשל זמן הטיפול הקצר), יעילות (גבול נמוך של זיהוי – לוד – ורגישות גבוהה) וספציפיות (לסוג הפתוגן היעד) כדי שיהיה פונקציונלי6.
בעבר, מבוססי EWOD מבוססת-מבוסס על בהצלחה עבור תמלול הפוכה התגובה שרשרת פולימראז (RT-PCR), זיהוי של פתוגן עמיד בפני אנטיביוטיקה (סטפילוקוקוס-עמיד בפני הבית או MRSA ), מ. דלקת ריאות ו ג. אלביאנים באמצעות שבב תקציב נמוך, מודפס מעגל לוח ו-magnetophoresis7. הטכניקה הוחלה גם על זיהוי של חומצה deoxyribonucleic (DNA) מוטציות באמצעות פירורצף וזיהוי כימולימינטאו18. הפלטפורמה מבוססי EWOD גם להרחיב את הפונקציונליות שלהם כלפי יישומים המערכת החיסונית, ובכך מאפשר שחזור המדגם בו ואיתור כל בתוך פלטפורמת אחת, משולבת. למשל, עיצוב הewod בודד הפגינו בהצלחה עם פלטפורמת dmf עבור בדיקות נקודת הטיפול עבור המערכת הן מבוססי חרוז מבוסס על-ידי החיסוני לב טרופונין אני מדגימת דם שלמה וכניסוי נפרד RT-PCR עבור זיהוי MRSA2. שבב זה מנצל שמן מילוי, אשר מונע אידוי של טיפות ומקלה על מניפולציה אוטומטית אמין של כרכים nanoliter. Bioapplications רב-תכליתי נחקרו עם יישום של גישות דומות dmf המכסים הומוגנית כמותית הטרוגנית חיסוני9,10 כולל עיצוב של ניסויים (DoE) מחקרים עבור הפרמטר מיטוב הפרמטרים11.
למרות היתרונות הבולטים שלה כדי לעבד התעצמות בשל כרכים עבודה זעיר, פלטפורמת DMF מלא שמן יכול להיות מאתגר ודורש רמת מומחיות מסוימת לפעול. מערכות שמן מלאות, כי הם דורשים רכיב אטום, אינם אידיאליים עבור יישום מסוימים בתחום שבו התחבורה המערכת חשובה. בנוסף, מערכת מבוססת נפט קשה מאוד אם לא בלתי אפשרי להשתמש עבור כמה יישומים ספציפיים לנצל את האוסף חומר יבש על פני השטח כגון הציע ז’או ו צ’ו12, jönsson-Niedziółka ואח‘,foat ואח ‘14. לעומת זאת, מערכות ללא שמן הן פשוטות להשתלב וליהנות ממתן תרגום קל של שבב לשבב לדוגמה. מסיבות אלה, השיטה המוצעת פותחה כדי לספק שיטת החיסונית מבוססת EWOD על DMF אשר לא ידרוש נפט, מפשט ביעילות את פעולת ההתקן.
בתרומה זו, אנו מדווחים על שימוש העידו, חופשי לעמוד, פלטפורמת DMF אוטומטית לחלוטין עבור המערכת החיסונית, ואנו לפרט על הפרוטוקול עבור גילוי מהיר של biomolecules, כלומר: חלבונים, וגטטיבי חיידקים, נבגים חיידקיים ווירוסים. שילוב של EWOD שבב עם חלקיקים מגנטיים עבור הכנה לדוגמה אוטומטית immunoprecipitation כבר הפגינו עם מדידה נוספת מחוץ לשורה MS15. לאחרונה, בתחום אבחון נגד חצבת אדמת igg כבר הפגינו באוכלוסייה מרחוק בצפון מערבי של קניה על ידי קבוצת וילר16. הן של ווילר והן של המערכת שלנו, להיות הניתנים להעברה, עצמית הכלול, אוטומטי לחלוטין עם כלול על שבב, מדידות כימי בזמן אמת הם ללא ספק בין המתקדמים ביותר DMF מערכות ביולוגי זמין.
שתי המערכות תוכננו עם יישומים שונים מאוד בראש. המערכת של וילר מטרות ביולוגיים כדי לאפשר אבחון ביו רפואי על מטופלים ואילו מערכת ביולוגית שלנו בנויה סביב דרישת ההגנה לאיתור ישיר של הפתוגן שנדגמו בעבר מהאוויר. הדמיון בין השניים הוא העיקרון הבסיסי של ה-droplet, אשר ממחיש את המגוון הרחב של מגזרים חיים המשפיעים על הטכנולוגיה מבוססת EWOD יכול להשפיע. כלומר, מבוססי DMF פלטפורמת זיהוי ומערכת EWOD הקשורים יכול למצוא משתמע מפתח בריאות (אבחון ביו רפואי); הגנה צבאית ואזרחית (גילוי איום); Agri-טק (ניטור חיתוך) ובטיחות עבודה (ניטור סביבה מבוקרת)
הביצועים של פלטפורמת DMF שלנו מוערך כנגד זיהוי אוטומטי מלא של אלבומין סרום האדם (HSA, חלבון כדורי), האנציכיה coli (E. coli, חיידקים וגטטיבי), באקלוס האטרופאג (BG, נבג בקטריאלי) ו MS2 (וירוס בקטריה). חשוב מכך, DMF המוצע-שיטה הוא תכליתי מאוד במובן כי נוגדנים ללכוד יכול להיות מוחלף כדי למקד את הזיהוי של אנטיגנים אחרים שונים מארבעת שנחשבים במאמר זה. צד מבוסס על הנוגדן המבוסס על חישה לחלוטין, פלטפורמת DMF יכול לבנות ליישום פוטנציאלי מבוסס על ביולוגית aptamer אלף, שבו חרוזים מגנטיים לשאת aptamers ספציפיים ללכוד ו/או זיהוי של נוקלאוטידים. העיצוב והמימוש של הרכיבים השונים המרכיבים את פלטפורמת DMF המשולבת, הכלולה לחלוטין באופן עצמאי, כולל מחולל צורת גל במתח גבוה ואלקטרוניקה כונן היא נחשפה במקום אחר6.
פרוטוקול המערכת החיסונית של EWOD גמיש ויכול לכלול מספר שונים של פעולות מעבדה (לדוגמה, אנטיגן לכידת, ערבוב, דגירה, מיצוי חרוזים, כביסה) בהתאם לסוג הגיב, יציבות ושימוש בדרישות המוגדרות על ידי פרוטוקול השימוש. כהוכחה לעיקרון, במאמר הנוכחי, שני פרוטוקולים של שיטת החיסונית נחשבים להצגת היישום של שמונה או עשר LUOs (איור 4) עם שבב ewod המתואר. כגון מזעור היתרונות של מיקרוליטר, כרכים בדידים של ריאגנטים/אנליטה המגבירים את היעילות של אליסה על ידי הפחתת הן הצריכה של ריאגנטים, הזמן הנדרש לכל פעולה, למעשה, הזמן ניסיוני הכולל (6 כדי 10 דקות). יתר על כן, הטיפול הוא אוטומטי עם מניפולציה מתוזמן של טיפות אשר מקטין וריאציות ומשפר את הדיוק של שיטת החיסוני17. בפורמט הנוכחי, הניסוי כולל טיפול ידני של טיפות בתחילת כל שיטת, שהיא נקודה לדיון נוסף בסעיף הבא.
צעד קריטי אחד בשיטת DMF הנוכחית מחלק את הטיפות על פני שבב ה-EWOD. בדרך כלל, מיקרופיפטה עם עצה חד פעמית משמש כדי למדוד את הנפח המדויק ולטעון אותו. עם זאת, זה יכול להיות מאתגר לשתק את ה-droplet על פני המים ההידרופובי של צלחת האקטואציה בגלל האינטראקציות בין ה-droplet לבין המשטח הטעון של הטיפ החד. כתוצאה מכך, ה-droplet יכול לצלם בעקבות המשטח החיצוני של הקצה במקום להישאר על הצלחת. כדי למנוע זאת, יש להחזיק את המיקרופיפטה בתנוחה זקופה, בניצב למשטח השבב, מבלי לגעת בו, ואז ניתן לפנות את ה-droplet למשטח הטעינה על ידי הבאת המגע עם פני השטח. אם ה-droplet נדבק לעצת הפיפטה, החזר אותה לפתרון המניה, החלף את העצה והחזר את ההפקדה הטרייה. בפיתוח נוסף של מערכת הוכחת הרעיון הנוכחית, משלוח אוטומטי של droplet ניתן לקנא.
צעד קריטי נוסף, לפני הפעלת הסדר, סוגר את המכסה של מכלול הלוחית המקבילית. כפי שצוין קודם לכן בפרוטוקול, יש להחליק את המכסה מעל לוחית האקטורות. משטח ההידרופובי של המכסה מונע עיוות ועקירה של טיפות היושבות על לוחית האקטורות. כדי להבטיח את התנועה החלקה של ה-droplet, מומלץ מאוד להשתמש בצלחת הגשמה טהורה, הטעינה הנכונה של טיפות והרכבת שבב. ניתן לשחזר את הצלחות האקטורות; עם זאת, מספר המחזורים תלוי במתח האקטואלי (איור 3) ובתצהיר האנליטה/מגיב על פני השטח, המכונה ביוקציה. הפלטפורמה המוצגת מנוצל כרום מודפס שבב EWOD, אשר ניתן להשתמש מחדש באופן אמין עבור מדידות רצופות עד ארבע פעמים במתח ההפעלה של 120 V ו צלחת ביניים ניקוי לאחר כל ניסוי. צלחות היו ממוחזרים, כדי להפחית את עלות לכל ניסוי, על ידי decontaminating (צחצוח את פני השטח עם סוכן ניקוי בלתי מדולל לפני שטיפה יסודית) fluoropolymers מאמורמים (לוח חומרים) ציפוי וציפוי ספין אחד על גבי הצלחת. עם זאת, מיחזור צלחת אקטוציה דורש טיפול ידני, ריאגנטים יקר (אמורפיים fluoropolymers (טבלת חומרים)) וציוד מיוחד (ספין-coater). שבבי ewod חלופיים נחקרים בהצלחה עם מצעים חסכוניים כגון נייר19, סרטים אצטט או לוחותמעגלים מודפסים(pcb)20,21. מתכלים אלה חד פעמיות יכול להקל על שימוש אמין ובמחיר סביר של פלטפורמת DMF והוא יכול לספק אמצעים כדי לשלב את הבעיה ביואולבינג.
ביובאינג היא המגבלה העיקרית של EWOD ליישומים ביולוגיים22, 23. מחקרים מוקדמים יותר על DMF זיהו שני מנגנונים התורמים לביוקציה, כלומר, ספיחה פסיבית עקב אינטראקציות הידרופובי, ומפגינה ספיחה אלקטרוסטטית מונחה כאשר שדה חשמלי מוחל24. הממצאים במאמר הנוכחי תואמים את התיאוריה הזאת כפי שהוא תיעד את הצלחת האקטואציה פוחתת התמדה במתח הגשמה גבוה. הסבר אחד אפשרי הוא כי החלבונים ספוח בקלות על Fluoropolymer מצופה (טפלון) משטחים והם מצטברים מהר יותר על עבירה בהשוואה משטחים בתוליים24. כתוצאה מכך, הקשורות חלבון מוסר ב DMF קשה לכמת ועלול להיתקל באובדן של אנליטה, הזיהום הצולב ודיוק מופחת17. התרחיש הגרוע ביותר הוא כאשר כמות קריטית של החלבון adsorbs ובכך לעיבוד המכשיר חסר תועלת. כדי למזער את הביו-שיטות, הגישות השונות נחקרו מפני הפחתת זמן המגורים של ה-droplet על השבב, דרך ציפויים23, לתוספים (כלומר, חומרים מסוררים או חומצה פלורליסטית) לתוך טיפות הביותית6, 22. מכאן, היבט חשוב של שיטת החיסונית על EWOD היא לבחור אסטרטגיות אנטי-ביוגיות התואמות את הפרוטוקול הספציפי בהישג יד.
פלטפורמת DMF אוטומטית נועד לבצע בדיקת סנדוויץ ‘ אחד בודד לכל לרוץ תוך שימוש בכרכים מיקרו ליטר הן ריאגנטים ו-אנליטה. כאשר נדרש, כריך קונבנציונלי ערכות אליסה להתקיים מבוסס על מצופה מראש 96-טוב או 384-טוב צלחות כי בשילוב עם ציוד מעבדה עזר תוצאה תפוקה גבוהה יותר לכל הפעלה; מבוסס על מחיר ריאגנטים בלבד, עלות משוער לכל מידה/גם הוא 6.04 USD (580 USD/96) ו 0.33 USD (2 × 580 USD/384) בהתאמה. הדבר מעבד את שיטות ה-אליסה הקונבנציונליות האידיאליות עבור מספר רב של דגימות המעובדות בדרך כלל על ידי אנשי מעבדה טכניים במתקני המעבדה המרוכזים. עם זאת, במיקומים מרוחקים, ניתוח עלות מפורטת של אליסה לניטור סביבתי הראה כי כאשר עלויות ההון (כלומר, עלויות הפעלה מעבדה, עלויות חוזרות, לדוגמה הובלה, אספקה וכוח אדם) היו כלולים מחיר בפועל לכל אליסה היה 60 USD של אשר 34 USD היו עבור אספקה לכל לדוגמה25. לעומת זאת, פלטפורמת DMF המוצעת היא ניידת, הדורשת הכשרה מינימלית לתפעול ומחרוזות מצופות מראש, המספקות ניתוח מדגם לתשובה בדקות. מכאן, ניתן לפרוס את הטכנולוגיה המוצגת למקומות שבהם צריך להיות נקודת הצורך וניתוחים משלימים הזמינים אחרת במעבדות ממורכזות.
בסעיף תוצאות הנציג, הפלטפורמה האוטומטית של המערכת החיסונית DMF שימש לזיהוי ישיר של פתוגנים עבור בקשה להגנה. יישומים אפשריים אחרים עבור פלטפורמת DMF מקיפים אך אינם מוגבלים, bioאבחוניים, ניטור רציפה ודגימה אוטומטית. פוטנציאל dmf יכול להשפיע מגזרים שונים מנקודת הטיפול עבור בריאות אישית, כמו גם פיקוח על הסביבה מבוקרת להגנה על חולים מפני זיהום מוטס החולים נרכש, כדי לחתוך מערכת ניטור עבור חקלאות ו ייצור מזון.
The authors have nothing to disclose.
ברצוני להכיר בתרומתו של עמיתינו מקבוצת המחקר המיקרופלואידיג & לעבודתם בתכנון המכני ובשילוב המערכת. המחברים רוצים להודות Dstl Porton למטה על התמיכה שלהם יסולא בפז ועל התרומה הפיננסית שלהם, בעבר פרויקטים שוטפים שמפתחים עוד את טכנולוגיית DMF ויישומיה.
(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES | Sigma-Aldrich | H9897 | |
Anti-Human Serum Albumin [15C7] | Abcam | ab10241 | |
Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP) | Abcam | ab24438 | |
B. atrophaeus (BG) spores | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Blocker Casein | Thermo Scientific | TFS 37582 | |
CNC Dicing/Cutting Saw | MTI Corp, USA | SYJ-400 | |
Cytop | AGC, Japan | CTL-809M | Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating. |
E. coli MRE 162 | Dstl, UK | N/a | |
Goat anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Hamamatsu photodiode | Hamamatsu, Japan | S9270 | |
Hidrochloric acid (32%) | Sigma-Aldrich | W530574 | |
Mask manufacturing service | Compugraphics, Scotland, UK | N/a | |
MS2 virus | Dstl, UK | N/a | |
Parylene-C, DPX-C | Specialty Coating System, USA | CAS No.: 28804-46-8 | |
Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit | Thermo Scientific | 88828 | Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 °C. |
Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS | Abcam | ab201876 | |
SCS Parylene Deposition System | Specialty Coating System, USA | 2010 | |
Silicon wafer, 4'', p-type, <100>, 1–10 Ωcm | Pi Kem Ltd | N/a | |
Spin Coater | SÜSS MicroTec AG, Germany | ||
SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Scientific | 37075 | It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 °C. |
Tween 80 | Thermo Scientific | 28328 | The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution. |