Microfluido digital à base de eletrowetting é uma técnica que utiliza uma mudança impulsionada por tensão no ângulo de contato aparente de uma gotícula de volume de microlitros para facilitar sua manipulação. Combinar isso com contas magnéticas funcionais permite a integração de múltiplas operações de unidades laboratoriais para preparação e identificação de patógenos usando Oensaio Imunosorbent ligado à enzima (ELISA).
Eletrowetting é o efeito pelo qual o ângulo de contato de uma gotícula exposta a uma carga de superfície é modificado. O eletrowetting-on-dielectric (EWOD) explora as propriedades dielétricas de filmes isoladores finos para aumentar a densidade de carga e, portanto, aumentar o efeito eletrowetting. A presença de acusações resulta em uma propagação eletricamente induzida da gotícula que permite manipulação proposital em uma superfície hidrofóbica. Aqui, demonstramos o protocolo baseado em EWOD para processamento e detecção de amostras de quatro categorias de antígenos, utilizando uma plataforma automatizada de atuação de superfície, através de duas variações de métodos de Ensaio Imunosorbent (ELISA) ligados à enzima. A ELISA é realizada em contas magnéticas com anticorpos primários imobilizados que podem ser selecionados para atingir um antígeno específico. Um anticorpo conjugado ao HRP liga-se ao antígeno e é misturado com H2O2/Luminol para quantificação dos patógenos capturados. Foram alcançados prazos de conclusão entre 6 e 10 minutos, enquanto volumes minúsculos de reagentes foram utilizados.
O método proposto visa facilitar a preparação automatizada de amostras para a ELISA com detecção quantitativa de antígenos usando abordagem baseada em EWOD com microfluidos digitais (DMF) e separação magnetofóbica. Foi demonstrado por múltiplas aplicações biológicas que o DMF em combinação com magnetoforese é uma alternativa interessante às aplicações de manuseio líquido1. Mais especificamente, a detecção de patógenos é um aspecto implícito em muitos setores, desde a saúde2 até a agricultura e o meio ambiente3,4 até a segurança nacional5. Uma tecnologia de detecção capaz de lidar com as ameaças de patógenos deve apresentar alto throughput (por exemplo, tempo curto de ensaio), eficiência (baixo Limite de Detecção – LoD – e alta sensibilidade) e especificidade (para o tipo de patógeno alvo) para que seja funcional6.
Anteriormente, o DMF baseado em EWOD foi implementado com sucesso para a Reação da Corrente de Polimerésia de Transcrição Reversa (RT-PCR), detecção de um patógeno resistente a antibióticos (Staphylococcus resistente à Meticilina aureaus ou MRSA), M.pneumonia e C.albicans usando um chip de placa de circuito impresso de baixo orçamento e magnetoforose7. A técnica foi aplicada também para a detecção de mutações de ácido desoxiribonucleico (DNA) através de pirosequenciamento e detecção quimioiluminescente8. As plataformas baseadas em EWOD também expandem sua funcionalidade para aplicativos de imunoensaio, permitindo assim a recuperação e detecção simultânea de amostras dentro de uma única plataforma integrada. Por exemplo, um único design de chip EWOD foi demonstrado com sucesso com uma plataforma DMF para testes de ponto de cuidado para ambos imunoensaios à base de contas de troponina cardíaca I de uma amostra de sangue inteira e como um experimento separado RT-PCR para detecção do MRSA2. Esse chip utiliza enchimento de óleo, o que previne a evaporação das gotículas e facilita a manipulação automatizada confiável de volumes de nanoliter. Bioaplicações versátils foram investigadas com a implementação de abordagens semelhantes de DMF que abrangem imunoensaios quantitativos homogêneos e heterogêneos9,10, incluindo projeto de estudos de experimentos (DoE) para otimização de parâmetros de ensaio11.
Apesar de seus méritos óbvios para processar a intensificação devido aos volumes de trabalho minúsculos, uma plataforma dmf cheia de óleo pode ser desafiadora e requer um certo nível de experiência para operar. Sistemas cheios de óleo, por necessitarem de componentes lacrados, não são ideais para uma determinada aplicação em campo onde a transporte do sistema é importante. Além disso, um sistema à base de petróleo seria muito difícil se não impossível de usar para algumas aplicações específicas aproveitando a coleta de material seco em uma superfície como proposta por Zhao e Cho12, Jönsson-Niedziółka et al.13, e Foat et al.14. Em contraste, sistemas livres de óleo são simples de integrar e têm a vantagem de fornecer uma tradução fácil de amostra chip-to-chip. Por essas razões, o método proposto foi desenvolvido para fornecer um imunoensaio baseado em EWOD no DMF que não exigiria petróleo, simplificando efetivamente a operação do dispositivo.
Nesta contribuição, relatamos sobre o uso de uma plataforma DMF medida, autônoma e totalmente automatizada para imunoensaios, e elaboramos sobre o protocolo para a rápida detecção de biomoléculas, ou seja: proteínas, bactérias vegetativas, esporos bacterianos e vírus. A combinação de chip EWOD com partículas magnéticas para preparação automatizada de amostras e imunoprecipitação já foi demonstrada com uma medição adicional de MS fora da linha15. Recentemente, o diagnóstico em campo contra o sarampo e a rubéola IgG foi demonstrado na remota população do Noroeste do Quênia pelo grupo Wheeler16. Tanto wheeler e nosso sistema, sendo transportável, autônomo, totalmente automatizado com medições chemiluminescentes incluídas no chip e em tempo real estão indiscutivelmente entre os sistemas de biodetecção dmf mais avançados disponíveis.
Os dois sistemas foram projetados com aplicações muito diferentes em mente. O sistema de Wheeler tem como alvo o biomarcador para permitir diagnósticos biomédicos em pacientes, enquanto nosso sistema de biodetecção é construído em torno da exigência de defesa para detecção direta de patógeno previamente amostrado de ar. A semelhança entre os dois é o princípio subjacente da atuação de gotículas, que demonstra a ampla gama de setores que influenciam a vida que a tecnologia baseada em EWOD pode impactar. Ou seja, a plataforma de detecção baseada em DMF e o sistema EWOD associado podem encontrar implicações fundamentais na saúde (diagnóstico biomédico); proteção militar e civil (detecção de ameaças); Agrotecnologia (monitoramento de culturas) e segurança do trabalho (monitoramento ambiental controlado)
O desempenho da nossa plataforma DMF é avaliado contra a detecção totalmente automatizada de albumina de soro humano (HSA, uma proteína globular), Escherichia coli (E. coli, uma bactéria vegetativa), Bacillus atrophaeus (BG, um esporo bacteriano) e MS2 (um vírus bacteriófago). Mais importante, o método proposto pela DMF é extremamente versátil no sentido de que os anticorpos de captura poderiam ser trocados para direcionar a detecção de outros antígenos diferentes dos quatro que são considerados neste artigo. Afastando totalmente o sensor de anticorpos, a plataforma DMF poderia construir para uma aplicação potencial baseada em biossensoriador aptamer, onde as contas magnéticas carregam aptamers específicos para captura e/ou detecção de nucleotídeos. O design e a realização dos diferentes componentes que constituem a plataforma DMF integrada e completamente auto-contida, incluindo o gerador de forma de onda de alta tensão e a eletrônica de unidade é divulgada em outros lugares6.
O protocolo de imunoensaio EWOD é flexível e pode incluir um número diversificado de operações de unidade de laboratório (por exemplo, capturar antígeno, mistura, incubação, extração de contas, lavagem) dependendo do tipo de reagente, estabilidade e requisitos de uso definidos pelo protocolo de ensaio. Como prova de princípio, no artigo atual, dois protocolos de imunoensaio são considerados mostrando a implementação de oito ou dez LUOs (Figura 4) com o chip EWOD descrito. Tal miniaturização merece do microlitro, volumes discretos de reagentes/analyte que aumentam a eficácia da ELISA, reduzindo tanto o consumo de reagentes, o tempo exigido por operação, essencialmente, o tempo experimental total (6 a 10 min). Além disso, o ensaio é automatizado com manipulação cronometrada das gotículas que diminui variações e melhora a precisão do imunoensaio17. Em seu formato atual, o experimento envolve o manuseio manual de gotículas no início de cada ensaio, o que é um ponto para uma discussão mais aprofundada na próxima seção.
Um passo crítico no método DMF atual é dispensar as gotículas na superfície do chip EWOD. Normalmente, uma micropipette com uma dica descartável é usada para medir o volume exato e carregá-la. No entanto, pode se tornar desafiador imobilizar a gotícula na superfície hidrofóbica da placa de atuação devido às interações entre a gotícula e a superfície carregada da ponta descartável. Como resultado, a gotícula pode disparar seguindo a superfície externa da ponta em vez de permanecer na placa. Para evitar isso, a micropipette deve ser mantida em posição vertical, perpendicular à superfície do chip, sem tocá-la, então a gotícula pode ser dispensada na almofada de carregamento, trazendo-a em contato com a superfície. Se a gota ficar com a ponta da pipeta, devolvê-la à solução de ações, trocar a ponta e redepositar uma gota fresca. Em um desenvolvimento adicional do atual sistema de prova de conceito, a entrega automática de gotículas pode ser prevista.
Outro passo crítico, antes de executar o ensaio, é fechar a tampa do conjunto da placa paralela. Como dito anteriormente no protocolo, a tampa deve ser deslizada em cima da placa de atuação. A superfície hidrofóbica da tampa evita a distorção e o deslocamento das gotículas sentadas na placa de atuação. Para garantir o movimento suave da gotícula, é altamente recomendável usar placa de atuação imaculada, carregamento correto das gotículas e montagem de chip. A reutilização das placas de atuação é possível; no entanto, o número de ciclos depende das tensões de atuação(Figura 3) e do depoimento analyte/reagente na superfície, também conhecido como biofouling. A plataforma apresentada utilizou chip EWOD estampado cromado, que poderia ser reutilizado de forma confiável para medições consecutivas até quatro vezes na tensão operacional de 120 V e limpeza de placas intermediárias após cada experimento. As placas foram recicladas, para reduzir o custo por experimento, descontaminando (escovando a superfície com agente de limpeza não diluído antes de enxaguar completamente) o revestimento fluoropolímero amorfo biofado(Tabela de Materiais)revestimento e revestimento de giro um fresco em cima da placa. No entanto, a reciclagem de placas de atuação requer manuseio manual, reagentes caros (fluoropolímeros amorfos (Tabela de Materiais))e equipamentos especializados (spin-coater). Chips EWOD alternativos são investigados com sucesso com substratos econômicos, como papel19,filmes de acetato ou placas de circuito impresso (PCBs)20,21. Tais materiais descartáveis podem facilitar o uso confiável e acessível da plataforma DMF e podem fornecer meios para evitar a questão da biofouling.
A biofouling é a principal limitação do EWOD para aplicações biológicas22,23. Estudos anteriores sobre dmf identificaram dois mecanismos que contribuem para a biofouling, ou seja, adsorção passiva devido a interações hidrofóbicas, e uma adsorção eletrostática se manifestando quando um campo elétrico é aplicado24. Os achados do artigo atual são consistentes com essa teoria, pois foi documentado que a reutilização da placa de atuação diminui em altas tensões de atuação. Uma possível explicação é que as proteínas adsorb prontamente em superfícies revestidas de Fluoropolímero (semelhante saque-like) e agregam mais rápido em falta em comparação com superfícies intocadas24. Como consequência, ensaios relacionados à proteína no DMF são difíceis de quantificar e podem experimentar perda de anestesia, contaminação cruzada e precisão reduzida17. O pior cenário é quando uma quantidade crítica de adsorjos proteicos, tornando assim o dispositivo inútil. Para minimizar a biofalta, várias abordagens têm sido investigadas desde a minimização do tempo de residência da gotícula no chip, passando por revestimentos23,até aditivos (ou seja, surfactantes ou ácido plurônico) nas gotículas carregadas de biomaterial6,22. Portanto, um aspecto importante do ensaio imunoensaio no EWOD é escolher estratégias anti-biofouling compatíveis com o protocolo específico em questão.
A plataforma automatizada DMF foi projetada para realizar um único teste ELISA de sanduíche por corrida, usando volumes de microlitros para reagentes e analyte. Quando é necessário, os kits convencionais de sanduíche ELISA existem com base em placas pré-revestidas de 96 poços ou 384 poços que, em combinação com equipamentos de laboratório auxiliar, resultam em maior rendimento por corrida; com base apenas no preço dos reagentes, o custo aproximado por ensaio/bem é de 6,04 USD (580 USD/96) e 0,33 USD (2×580 USD/384), respectivamente. Isso torna os métodos convencionais da ELISA ideais para um grande número de amostras processadas tipicamente por pessoal técnico treinado em instalações de laboratório centralizadas. No entanto, em locais remotos, a análise detalhada de custos da ELISA para monitoramento ambiental mostrou que quando os custos de capital (ou seja, custos operacionais laboratoriais, custos recorrentes, transporte amostral, suprimentos e pessoal) foram incluídos o preço real por ELISA foi de 60 USD dos quais 34 USD foram para suprimentos por amostra25. Em contraste, a plataforma DMF proposta é portátil, requer treinamento mínimo para operar e com contas pré-revestidas podem fornecer análise de amostra a resposta em minutos. Assim, a tecnologia apresentada pode ser implantada em locais de ponto de necessidade e complementar análises de outra forma disponíveis em laboratórios centralizados.
Na seção de resultados representativos, a plataforma automatizada de imunoensaio dMF foi utilizada para detecção direta de patógenos para aplicação de defesa. Outras aplicações possíveis para a plataforma DMF abrangem, mas não se limitam a, biodiagnóstico, monitoramento contínuo e amostragem automatizada. Potencialmente, o DMF poderia impactar diversos setores do ponto de atendimento à saúde personalizada, bem como monitoramento ambiental controlado para a proteção de pacientes da Infecção Adquirida Hospitalar Aerotransportada, ao sistema de monitoramento de culturas para agricultura e produção de alimentos.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de reconhecer a contribuição de nossos colegas do Grupo de Pesquisa em Microfluidos e Microengenharia por seu trabalho no projeto mecânico e integração do sistema. Os autores gostariam de agradecer a Dstl Porton Down por seu inestimável apoio e contribuição financeira, a projetos passados e em andamento que desenvolvem ainda mais a tecnologia DMF e suas aplicações.
(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES | Sigma-Aldrich | H9897 | |
Anti-Human Serum Albumin [15C7] | Abcam | ab10241 | |
Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP) | Abcam | ab24438 | |
B. atrophaeus (BG) spores | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Blocker Casein | Thermo Scientific | TFS 37582 | |
CNC Dicing/Cutting Saw | MTI Corp, USA | SYJ-400 | |
Cytop | AGC, Japan | CTL-809M | Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating. |
E. coli MRE 162 | Dstl, UK | N/a | |
Goat anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Hamamatsu photodiode | Hamamatsu, Japan | S9270 | |
Hidrochloric acid (32%) | Sigma-Aldrich | W530574 | |
Mask manufacturing service | Compugraphics, Scotland, UK | N/a | |
MS2 virus | Dstl, UK | N/a | |
Parylene-C, DPX-C | Specialty Coating System, USA | CAS No.: 28804-46-8 | |
Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit | Thermo Scientific | 88828 | Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 °C. |
Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS | Abcam | ab201876 | |
SCS Parylene Deposition System | Specialty Coating System, USA | 2010 | |
Silicon wafer, 4'', p-type, <100>, 1–10 Ωcm | Pi Kem Ltd | N/a | |
Spin Coater | SÜSS MicroTec AG, Germany | ||
SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Scientific | 37075 | It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 °C. |
Tween 80 | Thermo Scientific | 28328 | The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution. |