Электроуттинг на основе цифровой микрофлюидной является методом, который использует напряжение инициативе изменения в явном угол контакта микролитр-объем капли для облегчения его манипуляции. Сочетание этого с функционализированными магнитными бусинами позволяет интегрировать несколько лабораторных операций блока для подготовки образцов и идентификации патогенных микроорганизмов с использованием фермент-связанных Иммуносорбент Ассай (ELISA).
Электроутоктинг – это эффект, при котором изменяется угол контакта капли, подвергаемый поверхностному заряду. Электроутоктинг-на-диэлектрической (EWOD) использует диэлектрические свойства тонких изоляционных пленок для повышения плотности заряда и, следовательно, повысить эффект электроутирования. Наличие зарядов приводит к электрически индуцированному распространению капли, что позволяет целенаправленно ею манипулировать по гидрофобной поверхности. Здесь мы демонстрируем протокол на основе EWOD для обработки и обнаружения четырех категорий антигенов, используя автоматизированную платформу активации поверхности, с помощью двух вариаций ферментно-связанных иммуносорбентных асссе (ELISA). ELISA выполняется на магнитных бусинах с обездвиженные первичные антитела, которые могут быть выбраны для целевой конкретный антиген. Антитела, спряченные с HRP, связываются с антигеном и смешиваются с H2O2/Luminol для количественной оценки захваченных патогенов. Были достигнуты сроки завершения асса в размере от 6 до 10 мин, в то время как были использованы мизерные объемы реагентов.
Предлагаемый метод направлен на облегчение автоматизированной подготовки образцов для ELISA с количественным обнаружением антигенов с использованием ewOD-подхода с цифровыми микрофлюидами (DMF) и магнитофорным разделением. Было продемонстрировано для нескольких биологических приложений, что DMF в сочетании с магнитофорезом является интересной альтернативой жидкости обработки приложений1. В частности, выявление патогенных микроорганизмов является неявным аспектом во многих секторах, начиная от здравоохранения2 в сельском хозяйстве и окружающей среды3,4 для национальной безопасности5. Технология обнаружения, способная устранять угрозы от патогенных микроорганизмов, должна иметь высокую пропускную способность (например, короткое время асссе), эффективность (низкий предел обнаружения – LoD – и высокая чувствительность) и специфичность (к типу целевого патогена) для того, чтобы быть функциональным6.
Ранее, EWOD основе DMF была успешно реализована для обратной транскрипции Полимеразы цепной реакции (RT-PCR), обнаружение устойчивых к антибиотикам патогенов (метициллин-резистентный золотистый стафилококк или MRSA), М.пневмония и C.albicans с использованием низкобюджетной, печатной цепи чипа и магнитофореза7. Метод был применен также для обнаружения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) мутаций через пиросекевенцию и хемилюминесцентное обнаружение8. Платформы на основе EWOD также расширяют свою функциональность в сторону иммуноанализовых приложений, что позволяет одновременно восстанавливать и обнаруживать образец в рамках единой интегрированной платформы. Например, один EWOD-чип дизайн был успешно продемонстрирован с платформой DMF для точки-оф-медицинского тестирования для обоих бисера на основе иммуноанализа сердечного тропонина I из целого образца крови и в качестве отдельного эксперимента RT-PCR для обнаружения MRSA2. Этот чип использует масляный наполнитель, который предотвращает испарение капель и облегчает надежное автоматизированное манипулирование объемами нанолитров. Универсальные биоприменения были исследованы с реализацией аналогичных подходов DMF, охватывающих количественные однородные и неоднородные иммуноанализы9,10 в том числе дизайн экспериментов (DoE) исследования для проверки параметр оптимизации11.
Несмотря на свои очевидные достоинства для обработки интенсификации из-за незначительных объемов работы, заполненная нефтью платформа DMF может быть сложной и требует определенного уровня знаний для работы. Заполненные нефтью системы, поскольку они требуют герметичной составляющей, не являются идеальными для некоторых видов применения в поле, где транспортируемость системы имеет важное значение. Кроме того, на основе нефти система будет очень трудно, если не невозможно использовать для некоторых конкретных приложений, воспользовавшись сухой сбор материала на поверхности, такие, как предложенные Чжао и Чо12, Янссон-Нидзишка и др.13, и Foat и др.14. В отличие от этого, системы, свободные от масла, просты в интеграции и имеют преимущество, обеспечивая легкий перевод образцов от чипов к чипу. По этим причинам был разработан предлагаемый метод для обеспечения иммуноанализна на основе EWOD на DMF, который не требует масла, эффективно упрощая работу устройства.
В этом вкладе мы сообщаем об использовании индивидуальной, автономной, полностью автоматизированной платформы DMF для иммуноанализов, и мы подробно остраиваем протокол для быстрого обнаружения биомолекул, а именно: белки, вегетативные бактерии, бактериальные споры и вирусы. Комбинация EWOD-чипа с магнитными частицами для автоматизированной подготовки образца и иммунопрецициции была продемонстрирована уже с дополнительным автономным измерением MS15. Недавно, в поле диагностики против кори и краснухи IgG была продемонстрирована в отдаленных Северо-Западной Кении населения Уилер группы16. Оба Уилер и наша система, будучи транспортируемым, автономным, полностью автоматизированы с включенными на чипе, в режиме реального времени химилуминесцентных измерений, возможно, одним из самых передовых dMF биообнаружения систем.
Эти две системы были разработаны с очень разными приложениями в виду. Система Уилера нацелена на биомаркер, чтобы позволить биомедицинской диагностики пациентов в то время как наша система биообнаружения построена вокруг оборонных требований для прямого обнаружения патогена, ранее отобранного из воздуха. Сходство между ними является основополагающим принципом активации капель, который демонстрирует широкий спектр секторов, влияющих на жизнь, на которые может повлиять технология на основе EWOD. А именно, платформа обнаружения на основе DMF и связанная с ней система EWOD могут найти ключевое значение в области здравоохранения (биомедицинская диагностика); военная и гражданская защита (обнаружение угроз); Агротехнологии (мониторинг сельскохозяйственных культур) и безопасность труда (мониторинг окружающей среды)
Производительность нашей платформы DMF оценивается на фоне полностью автоматизированного обнаружения человеческого сывороточного альбумина (HSA, шаровый белок), Escherichia coli (E. coli, вегетативные бактерии), Bacillus atrophaeus (BG, бактериальная спорина) и MS2 (бактериофаг). Что еще более важно, предлагаемый метод DMF является чрезвычайно универсальным в том смысле, что захват антител может быть обменна для целевого обнаружения других антигенов отличается от четырех, которые рассматриваются в этой статье. Обход антител на основе зондирования полностью, платформа DMF может построить для потенциального приложения, основанного на aptamer биозондирования, где магнитные бусы нести конкретные aptamers для захвата и / или обнаружения нуклеотидов. Конструкция и реализация различных компонентов, составляющих интегрированную, полностью автономную платформу DMF, включая генератор высоковольтной формы волн и приводную электронику, раскрывается в другом месте6.
Протокол иммуноанализа EWOD является гибким и может включать в себя различные различные операции лабораторных подразделений (например, захват антигена, смешивание, инкубация, извлечение бисины, мытье) в зависимости от типа реагента, стабильности и использования требований, определенных протоколом ассировки. В качестве доказательства принципа, в текущей статье, два протокола иммуноанализ считается показ реализации восьми или десяти LUOs(Рисунок 4) с чипом EWOD описано. Такая миниатюризация заслуживает от микролитра, дискретных объемов реагентов/анализа, которые повышают эффективность ELISA за счет сокращения как потребления реагентов, времени, требуемого для операции, по сути, общего экспериментального времени (от 6 до 10 мин). Кроме того, анализ автоматизирован с приурочен манипуляции капель, что уменьшает вариации и улучшает точность иммуноанализ17. В своем нынешнем формате эксперимент включает в себя ручную обработку капель в начале каждого асссе, что является точкой для дальнейшего обсуждения в следующем разделе.
Одним из важнейших шагов в текущем методе DMF является распределение капель на поверхность чипа EWOD. Как правило, микропипетец с одноразовым наконечником используется для измерения точного объема и его загрузки. Тем не менее, это может стать сложной задачей, чтобы обездвижить капли на гидрофобной поверхности актуационной пластины из-за взаимодействия между каплями и заряженной поверхности одноразового наконечника. В результате, капля может стрелять вверх после внешней поверхности кончика, а не оставаясь на пластине. Чтобы избежать этого, микропайпет должен быть проведен в вертикальном положении, перпендикулярно поверхности чипа, не касаясь его, то капля может быть отпущена на погрузочную площадку, в результате чего его в контакт есот поверхности. Если капля прилипает к наконечнику пипетки, верните его в биржевой раствор, обменяйте наконечник и пересадите новую каплю. В ходе дальнейшего развития нынешней системы проверки концепции можно предусмотреть автоматическую доставку капель.
Другим важным шагом, прежде чем запустить ассс, является закрытие крышки параллельной сборки пластины. Как указано ранее в протоколе, крышка должна быть скользнула поверх актуационного пластины. Гидрофобная поверхность крышки предотвращает искажение и смещение капель, сидящих на актуационной пластине. Чтобы гарантировать плавное движение капли, настоятельно рекомендуется использовать нетронутую актуационную пластину, правильную загрузку капель и сборку чипов. Возможна повторное использование актуационных пластин; однако, количество циклов зависит от напряжения активации(рисунок 3)и осаждения аналита/реагента на поверхность, ака биофолинг. Представленная платформа использовала хромированный чип EWOD, который можно было надежно использовать для последовательных измерений до четырех раз при рабочем напряжении 120 В и промежуточной очистке пластин после каждого эксперимента. Плиты были переработаны, чтобы уменьшить стоимость за эксперимент, путем обеззараживания (щеткой поверхности с неразбавленным очистительным агентом перед тщательной промывкой) биофолированных аморфных фторполимеров(Таблица материалов) покрытие и спин-покрытие свежий на верхней части пластины. Однако для рециркуляции актуационных пластин требуется ручная обработка, дорогостоящие реагенты (аморфные фторполимеры(Таблица материалов))и специализированное оборудование (спин-пальто). Альтернативные чипы EWOD успешно исследуются с помощью экономически эффективных субстратов, таких как бумага19,ацетатные пленки или печатные плат (ПХД)20,21. Такие одноразовые расходные материалы могут способствовать надежному и доступному использованию платформы DMF и могут служить средством для обойти проблему биофолинга.
Биофолирование является основным ограничением EWOD для биологических применений22,23. Более ранние исследования по DMF определили два механизма, которые способствуют биофоллинга, а именно, пассивная адсорбция из-за гидрофобных взаимодействий, и электростатически управляемый адсорбции проявляется, когда электрическое поле применяется24. Выводы в текущей статье согласуются с этой теорией, как было документально активации пластины повторного использования уменьшается при высоком напряжении активации. Одним из возможных объяснений является то, что белки адсорбировать легко на фторполимер покрытием (тефлоновые) поверхностей, и они агрегируют быстрее на загрязненных по сравнению с нетронутой поверхностей24. Как следствие, связанные с белками анализы на DMF трудно количественно и могут испытывать потерю анализ, перекрестное загрязнение и снижение точности17. Наихудший сценарий, когда критическое количество белка адсорбты, таким образом, делает устройство бесполезным. Чтобы свести к минимуму биофоллинг, различные подходы были исследованы от минимизации времени пребывания капли на чипе, через покрытия23, до добавок (т.е. сурфактантов или плуронной кислоты) в биоматериал-Ладена капель6,22. Поэтому важным аспектом анализа иммуноанализа на EWOD является выбор стратегий по борьбе с биофоллингом, которые совместимы с конкретным протоколом.
Автоматизированная платформа DMF предназначена для выполнения одного теста ELISA сэндвича за пробег при использовании микролитровых объемов как для реагентов, так и для анализа. Когда это необходимо, обычные наборы сэндвич ELISA существуют на основе предварительно покрытием 96-наилучшим образом или 384-ну пластин, которые в сочетании с вспомогательным лабораторным оборудованием приводят к более высокой пропускной записи на пробег; исходя только по цене реагентов, примерная стоимость за асса/хорошо составляет 6,04 usd (580 USD/96) и 0,33 USD (2-580 USD/384) соответственно. Это делает традиционные методы ELISA идеальными для большого числа образцов, обработанных, как правило, квалифицированным техническим персоналом на централизованных лабораторных объектах. Однако в отдаленных районах подробный анализ затрат ELISA на экологический мониторинг показал, что, когда капитальные затраты (т.е. расходы на лабораторную эксплуатацию, периодические расходы, транспортировку образцов, принадлежности и персонал) включали фактическую цену за ELISA в размере 60 долларов США, из которых 34 доллара США составляли поставки на одну пробу25. В отличие от этого, предлагаемая платформа DMF является портативной, требует минимальной подготовки для работы и с предварительно покрытыми бусинами может обеспечить анализ от быта к ответу в считанные минуты. Таким образом, представленная технология может быть развернута в пунктах нуждаемых мест и дополнять анализы, в противном случае доступные в централизованных лабораториях.
В разделе репрезентативных результатов для прямого обнаружения патогенных микроорганизмов для применения в обороне использовалась автоматизированная платформа иммуноанализов DMF. Другие возможные приложения для платформы DMF охватывают, но не ограничиваются, биодиагностика, непрерывный мониторинг и автоматизированная выборка. Потенциально DMF может повлиять на различные сектора от точки-оф-медицинской помощи для персонализированного здравоохранения, а также контролируемый мониторинг окружающей среды для защиты пациентов от воздушно-капельной инфекции, к системе мониторинга урожая для сельского хозяйства и производства продуктов питания.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы отметить вклад наших коллег из Исследовательской группы по микрофлюидному и микроинженерному обеспечению в их работе по механическому проектированию и интеграции систем. Авторы хотели бы поблагодарить Dstl Porton Down за их неоценимую поддержку и финансовый вклад в прошлые и текущие проекты, которые в дальнейшем развивают технологию DMF и ее применение.
(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES | Sigma-Aldrich | H9897 | |
Anti-Human Serum Albumin [15C7] | Abcam | ab10241 | |
Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP) | Abcam | ab24438 | |
B. atrophaeus (BG) spores | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Blocker Casein | Thermo Scientific | TFS 37582 | |
CNC Dicing/Cutting Saw | MTI Corp, USA | SYJ-400 | |
Cytop | AGC, Japan | CTL-809M | Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating. |
E. coli MRE 162 | Dstl, UK | N/a | |
Goat anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Hamamatsu photodiode | Hamamatsu, Japan | S9270 | |
Hidrochloric acid (32%) | Sigma-Aldrich | W530574 | |
Mask manufacturing service | Compugraphics, Scotland, UK | N/a | |
MS2 virus | Dstl, UK | N/a | |
Parylene-C, DPX-C | Specialty Coating System, USA | CAS No.: 28804-46-8 | |
Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit | Thermo Scientific | 88828 | Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 °C. |
Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS | Abcam | ab201876 | |
SCS Parylene Deposition System | Specialty Coating System, USA | 2010 | |
Silicon wafer, 4'', p-type, <100>, 1–10 Ωcm | Pi Kem Ltd | N/a | |
Spin Coater | SÜSS MicroTec AG, Germany | ||
SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Scientific | 37075 | It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 °C. |
Tween 80 | Thermo Scientific | 28328 | The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution. |