El microfluídico digital basado en electrohumección es una técnica que utiliza un cambio impulsado por voltaje en el ángulo de contacto aparente de una gota de volumen de microlitros para facilitar su manipulación. La combinación de esto con perlas magnéticas funcionalizadas permite la integración de múltiples operaciones de unidades de laboratorio para la preparación de muestras y la identificación de patógenos utilizando el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
La electrohumectación es el efecto por el cual se modifica el ángulo de contacto de una gota expuesta a una carga superficial. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) explota las propiedades dieléctricas de las películas aislantes delgadas para mejorar la densidad de carga y, por lo tanto, aumentar el efecto electrohumante. La presencia de cargas resulta en una propagación inducida eléctricamente de la gota que permite una manipulación intencional a través de una superficie hidrófoba. Aquí, demostramos el protocolo basado en EWOD para el procesamiento de muestras y la detección de cuatro categorías de antígenos, utilizando una plataforma de accionamiento de superficie automatizada, a través de dos variaciones de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). El ELISA se realiza en cuentas magnéticas con anticuerpos primarios inmovilizados que se pueden seleccionar para atacar un antígeno específico. Un anticuerpo conjugado con HRP se une al antígeno y se mezcla con H2O2/Luminol para la cuantificación de los patógenos capturados. Se alcanzaron tiempos de finalización del ensayo de entre 6 y 10 minutos, mientras que se utilizaron volúmenes minúsculos de reactivos.
El método propuesto tiene como objetivo facilitar la preparación automatizada de muestras para ELISA con detección cuantitativa de antígenos utilizando un enfoque basado en EWOD con microfluídico digital (DMF) y separación magnetoforética. Se ha demostrado para múltiples aplicaciones biológicas que DMF en combinación con magnetophoresis es una alternativa interesante a las aplicaciones de manipulación de líquidos1. Más concretamente, la detección de patógenos es un aspecto implícito en muchos sectores, que van desde la sanidad2 hasta la agricultura y el medio ambiente3,4 a la seguridad nacional5. Una tecnología de detección capaz de abordar las amenazas de patógenos debe incluir alto rendimiento (por ejemplo, tiempo de ensayo corto), eficiencia (bajo límite de detección – LoD – y alta sensibilidad) y especificidad (al tipo de patógeno objetivo) para que sea funcional6.
Anteriormente, dMF basado en EWOD se ha implementado con éxito para la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR), la detección de un patógeno resistente a los antibióticos (Staphylococcus aureaus o MRSA resistente a la meticilina), M.pneumonia y C.albicans utilizando un chip de circuito impreso de bajo presupuesto y magnetophoresis7. La técnica se aplicó también para la detección de mutaciones de ácido desoxirribonucleico (ADN) a través de la pirosequencing y la detección quimioluminiscente8. Las plataformas basadas en EWOD también amplían su funcionalidad hacia aplicaciones de inmunoensayo, lo que permite la recuperación y detección simultánea según la cual las muestras se encuentran dentro de una única plataforma integrada. Por ejemplo, un único diseño de chip EWOD se demostró con éxito con una plataforma DMF para pruebas de punto de atención para inmunoensayos basados en cuentas de troponina cardiaca I a partir de una muestra de sangre completa y como un experimento separado RT-PCR para la detección de SARM2. Ese chip utiliza relleno de aceite, lo que evita la evaporación de las gotas y facilita la manipulación automatizada confiable de volúmenes de nanolitros. Se investigaron bioaplicaciones versátiles con la implementación de enfoques DMF similares que abarcaron inmunoensayos cuantitativos homogéneos y heterogéneos9,10 incluyendo el diseño de estudios de experimentos (DoE) para la optimización de parámetros de ensayo11.
A pesar de sus evidentes méritos para la intensificación del proceso debido a los volúmenes de trabajo minúsculos, una plataforma DMF llena de petróleo puede ser desafiante y requiere un cierto nivel de experiencia para operar. Los sistemas llenos de aceite, debido a que requieren componentes sellados, no son ideales para ciertas aplicaciones en el campo donde la transportabilidad del sistema es importante. Además, un sistema a base de aceite sería muy difícil, si no imposible de utilizar para algunas aplicaciones específicas, aprovechando la recolección de material seco en una superficie como la propuesta por Zhao y Cho12, J-nsson-Niedzió-ka et al.13, y Foat et al.14. Por el contrario, los sistemas sin aceite son fáciles de integrar y tienen la ventaja de proporcionar una fácil traducción de muestras de chip a chip. Por estas razones, el método propuesto se desarrolló para proporcionar un inmunoensayo basado en EWOD en DMF que no requeriría aceite, simplificando efectivamente el funcionamiento del dispositivo.
En esta contribución, informamos sobre el uso de una plataforma DMF a medida, independiente y totalmente automatizada para inmunoensayos, y profundizamos en el protocolo para la detección rápida de biomoléculas, a saber: proteínas, bacterias vegetativas, esporas bacterianas y virus. La combinación de chip EWOD con partículas magnéticas para la preparación automatizada de muestras y la inmunoprecipitación ya se ha demostrado con una medición adicional de MS fuera de línea15. Recientemente, el grupo16de Wheeler ha demostrado un diagnóstico sobre el sarampión y la rubéola IgG en la población remota del noroeste de Kenia. Tanto Wheeler como nuestro sistema, siendo transportable, autónomo, totalmente automatizado con mediciones quimioluminiscentes en chip incluidas, son posiblemente uno de los sistemas de biodetección DMF más avanzados disponibles.
Los dos sistemas han sido diseñados con aplicaciones muy diferentes en mente. El sistema de Wheeler se dirige al biomarcador para permitir el diagnóstico biomédico en pacientes, mientras que nuestro sistema de biodetección se basa en los requisitos de defensa para la detección directa de patógenos previamente muestreados desde el aire. La similitud entre los dos es el principio subyacente de la actuación de gotas, que demuestra la amplia gama de sectores que influyen en la vida que la tecnología basada en EWOD puede afectar. A saber, la plataforma de detección basada en DMF y el sistema EWOD asociado podrían encontrar implicaciones clave en la salud (diagnóstico biomédico); protección militar y civil (detección de amenazas); Tecnología agropecual (monitoreo de cultivos) y seguridad en el trabajo (monitoreo controlado del medio ambiente)
El rendimiento de nuestra plataforma DMF se evalúa en función de la detección totalmente automatizada de albúmina sérica humana (HSA, una proteína globular), Escherichia coli (E. coli, una bacteria vegetativa), Bacillus atrophaeus (BG, una espora bacteriana) y MS2 (un virus bacteriófago). Más importante aún, el método DMF propuesto es extremadamente versátil en el sentido de que los anticuerpos de captura podrían intercambiarse para apuntar a la detección de otros antígenos diferentes de los cuatro que se consideran en este artículo. Al evitar por completo la detección basada en anticuerpos, la plataforma DMF podría construirse hasta una aplicación potencial basada en el bioensing de aptámeros, donde las perlas magnéticas llevan aptámeros específicos para la captura y/o detección de nucleótidos. El diseño y la realización de los diferentes componentes que constituyen la plataforma DMF integrada y completamente autónoma, incluyendo el generador de forma de onda de alta tensión y la electrónica de accionamiento se divulga en otros lugares6.
El protocolo de inmunoensayo EWOD es flexible y puede incluir un número diverso de operaciones de unidades de laboratorio (por ejemplo, antígeno de captura, mezcla, incubación, extracción de cuentas, lavado) dependiendo del tipo de reactivo, estabilidad y requisitos de uso definidos por el protocolo de ensayo. Como prueba de principio, en el artículo actual, se consideran dos protocolos de inmunoensayo que muestran la implementación de ocho o diez LUOs (Figura 4) con el chip EWOD descrito. Esta miniaturización merece del microlitro, volúmenes discretos de reactivos/analitos que aumentan la eficacia del ELISA reduciendo tanto el consumo de reactivos, el tiempo requerido por operación, esencialmente, el tiempo experimental total (6 a 10 min). Además, el ensayo se automatiza con manipulación cronometrada de las gotas que disminuye las variaciones y mejora la precisión del inmunoensayo17. En su formato actual, el experimento implica el manejo manual de gotas al principio de cada ensayo, que es un punto para seguir discutiendo en la siguiente sección.
Un paso crítico en el método DMF actual es la dispensación de las gotas en la superficie del chip EWOD. Normalmente, se utiliza un micropipeta con una punta desechable para medir el volumen exacto y cargarlo. Sin embargo, puede llegar a ser difícil inmovilizar la gota en la superficie hidrófoba de la placa de accionamiento debido a las interacciones entre la gota y la superficie cargada de la punta desechable. Como resultado, la gota puede disparar hacia arriba siguiendo la superficie exterior de la punta en lugar de permanecer en la placa. Para evitar esto, el micropitón debe mantenerse en posición vertical, perpendicular a la superficie de la viruta, sin tocarla, entonces la gota se puede dispensar en la plataforma de carga poniéndola en contacto con la superficie. Si la gota se pega a la punta de la pipeta, devuélvala a la solución de stock, cambie la punta y vuelva a depositar una gota nueva. En un desarrollo posterior del actual sistema de prueba de concepto, se puede prever la entrega automática de gotas.
Otro paso crítico, antes de ejecutar el ensayo, es cerrar la tapa del conjunto de placas paralelas. Como se indicó anteriormente en el protocolo, la tapa debe deslizarse en la parte superior de la placa de accionamiento. La superficie hidrófoba de la tapa evita la distorsión y el desplazamiento de las gotas que se sientan en la placa de accionamiento. Para garantizar el movimiento suave de la gota, se recomienda utilizar una placa de accionamiento prístina, la carga correcta de las gotas y el conjunto de la viruta. La reutilización de las placas de accionamiento es posible; sin embargo, el número de ciclos depende de las tensiones de accionamiento(Figura 3) y la deposición de analito/reactivo sobre la superficie, también conocida como biofouling. La plataforma presentada utilizaba chip EWOD impreso en cromo, que podría ser reutilizado de forma fiable para mediciones consecutivas hasta cuatro veces en voltaje de funcionamiento de 120 V y limpieza de placas intermedias después de cada experimento. Las placas se reciclaron, para reducir el costo por experimento, descontaminando (cepillar la superficie con agente limpiador sin diluir antes de enjuagar a fondo) los fluoropolímeros amorfos biofouled(Tabla de Materiales)recubriendo y recubriendo un nuevo en la parte superior de la placa. Sin embargo, el reciclaje de placas de accionamiento requiere manipulación manual, costosos reactivos (fluoropolímeros amorfos(Tabla de materiales))y equipos especializados (revestimiento de espín). Los chips EWOD alternativos se investigan con éxito con sustratos rentables como papel19,películas de acetato o placas de circuito impreso (PCB)20,21. Estos consumibles desechables pueden facilitar un uso fiable y asequible de la plataforma DMF y pueden proporcionar medios para evitar el problema del biofouling.
El biofouling es la principal limitación de EWOD para aplicaciones biológicas22,23. Estudios anteriores sobre DMF han identificado dos mecanismos que contribuyen al biofouling, a saber, la adsorción pasiva debido a interacciones hidrofóbicas, y una adsorción impulsada electrostáticamente que se manifiesta cuando se aplica un campo eléctrico24. Los hallazgos en el artículo actual son consistentes con esta teoría, ya que se documentó la reusabilidad de la placa de accionamiento disminuye en voltajes de accionamiento altos. Una posible explicación es que las proteínas se absorben fácilmente en superficies recubiertas de fluoropolímero (como teflón) y se agregan más rápido en fouled en comparación con superficies prístinas24. Como consecuencia, los ensayos relacionados con proteínas en DMF son difíciles de cuantificar y pueden experimentar pérdida de analito, contaminación cruzada y disminución de la precisión17. El peor de los casos es cuando una cantidad crítica de adsorbes de proteínas, lo que hace que el dispositivo sea inútil. Para minimizar el biofouling, se han investigado varios enfoques desde la minimización del tiempo de residencia de la gota en el chip, a través de recubrimientos23,hasta aditivos (es decir, tensioactivos o ácido plurónico) en las gotas debiomateriales cargados 6,22. Por lo tanto, un aspecto importante del ensayo de inmunoensayo en EWOD es elegir estrategias antibiofouling que sean compatibles con el protocolo específico en cuestión.
La plataforma DMF automatizada está diseñada para realizar una sola prueba ELISA de sándwich por carrera mientras se utilizan volúmenes de microlitros tanto para reactivos como para analitos. Cuando se requiere, existen kits ELISA sándwich convencionales basados en placas pre-recubiertas de 96 o 384 pocillos que en combinación con equipos de laboratorio auxiliares dan como resultado un mayor rendimiento por carrera; Basado en el precio de los reactivos solamente, el costo aproximado por ensayo/pozo es de 6.04 USD (580 USD/96) y 0.33 USD (2-580 USD/384) respectivamente. Esto hace que los métodos ELISA convencionales sean ideales para un gran número de muestras procesadas típicamente por personal técnico capacitado en instalaciones de laboratorio centralizadas. Sin embargo, en ubicaciones remotas, el análisis detallado de los costos de ELISA para el monitoreo ambiental mostró que cuando los costos de capital (es decir, los costos de operación de laboratorio, los costos recurrentes, el transporte de muestras, los suministros y el personal) se incluyeron el precio real por ELISA era de 60 USD de los cuales 34 USD eran para suministros por muestra25. Por el contrario, la plataforma DMF propuesta es portátil, requiere un entrenamiento mínimo para operar y con cuentas pre-recubiertas puede proporcionar análisis de muestra a respuesta en cuestión de minutos. Por lo tanto, la tecnología presentada se puede implementar en ubicaciones de puntos de necesidad y complementar los análisis disponibles de otro modo en laboratorios centralizados.
En la sección de resultados representativos, se utilizó la plataforma de inmunoensayo SMF automatizada para la detección directa de patógenos para la aplicación de defensa. Otras aplicaciones posibles para la plataforma DMF abarcan, pero no se limitan a, biodiagnóstico, monitoreo continuo y muestreo automatizado. Potencialmente, el DMF podría afectar a diversos sectores, desde el punto de atención para la atención sanitaria personalizada, así como la vigilancia controlada del medio ambiente para la protección de los pacientes de la infección adquirida hospitalaria, hasta el sistema de monitoreo de cultivos para la agricultura y la agricultura y producción de alimentos.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría reconocer la contribución de nuestros colegas del Grupo de Investigación de Microfluidic & Microengineering por su trabajo en el diseño mecánico y la integración del sistema. Los autores desean agradecer a Dstl Porton Down por su inestimable apoyo y contribución financiera, a proyectos pasados y en curso que desarrollan aún más la tecnología DMF y sus aplicaciones.
(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES | Sigma-Aldrich | H9897 | |
Anti-Human Serum Albumin [15C7] | Abcam | ab10241 | |
Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP) | Abcam | ab24438 | |
B. atrophaeus (BG) spores | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Blocker Casein | Thermo Scientific | TFS 37582 | |
CNC Dicing/Cutting Saw | MTI Corp, USA | SYJ-400 | |
Cytop | AGC, Japan | CTL-809M | Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating. |
E. coli MRE 162 | Dstl, UK | N/a | |
Goat anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Hamamatsu photodiode | Hamamatsu, Japan | S9270 | |
Hidrochloric acid (32%) | Sigma-Aldrich | W530574 | |
Mask manufacturing service | Compugraphics, Scotland, UK | N/a | |
MS2 virus | Dstl, UK | N/a | |
Parylene-C, DPX-C | Specialty Coating System, USA | CAS No.: 28804-46-8 | |
Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit | Thermo Scientific | 88828 | Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 °C. |
Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS | Abcam | ab201876 | |
SCS Parylene Deposition System | Specialty Coating System, USA | 2010 | |
Silicon wafer, 4'', p-type, <100>, 1–10 Ωcm | Pi Kem Ltd | N/a | |
Spin Coater | SÜSS MicroTec AG, Germany | ||
SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Scientific | 37075 | It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 °C. |
Tween 80 | Thermo Scientific | 28328 | The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution. |