Summary
本文介绍的是一种在斑马鱼和管状细胞中对斑马鱼进行全位RNA杂交分析的协议,在患者诱导的多能干细胞衍生内皮细胞中进行管状分析,以研究内索林在血管形成中的作用。
Abstract
血管发育由特定基因的连续表达决定,可在不同发育阶段对斑马鱼进行原位杂交测定进行研究。为了研究在遗传性出血性特朗吉性(HHT)发展过程中,在血管形成中的作用,利用斑马鱼中拟定的定向击倒来研究其时间表达和相关功能。在这里,全位原地RNA杂交(WISH)用于分析斑马鱼胚胎中的eng及其下游基因。此外,在HHT患者诱导多能干细胞分化内皮细胞(iPSC-ECs;具有eng突变)中进行管状检测。使用整量原位杂交的特定信号放大系统 – 与传统方法相比,WISH 可提供更高的分辨率和更低的背景效果。为了获得更好的信号,在探头杂交后,固定后时间将调整为30分钟。由于荧光染色在斑马鱼胚胎中不敏感,因此在这里被二氨基丁(DAB)染色所取代。在此协议中,含有eng突变的HHT患者衍生iPSC系分化成内皮细胞。在37°C下涂了30分钟的基底膜基质后,iPSC-EC作为单层播种成井,并保持在37°C3小时。然后,使用微观图像计算管长和分支数。因此,通过这种改进的WISH协议,表明减少的英性表达会影响斑马鱼胚胎的内皮祖祖形成。这进一步证实了使用从HHT患者的iPSC-ECs的管形测定。这些测定证实了eng在早期血管发育中的作用。
Introduction
在HHT患者中eng报告了eng(CD105)的单突变。突变导致EC增殖增加和减少流动介导EC伸长11,2。2也曾报道,ENG缺乏减少内皮标记表达(即,kdrl,cdh5,嘿2)在斑马鱼cdh53。Endoglin,主要以内皮细胞表示,是一种跨膜糖蛋白,是转化生长因子β(TGF-+)家庭成员的共同受体。它引导BMP9结合在细胞表面,以调节下游基因,包括Id1表达,诱导干细胞分化到ECs4。因此,eng基因在血管生成和人类血管疾病55、66中起着重要的作用。我们以前曾研究过苯丙烯酶在斑马鱼胚胎中撞击血管形成的影响,然后分析从具有eng突变7的HHT患者那里获得的iPSCs衍生的ECs。该协议演示了ENG缺乏对内皮祖体标记表达和管的形成的影响,这是一种测量体外血管生成的方法。
为了研究英语空间和时间表达,WISH用于检测体内基因表达8。原位杂交 (ISH) 是一种使用带有目标核酸(DNA 或 mRNA)补充序列的标签探头来检测和可视化固定试样中的目标核酸混合物的方法。该过程放大体内的基因表达信号,用于通过显微镜检测基因的表达。WISH已广泛应用于各种模型动物,特别是在斑马鱼9。它还用于获取以下数据:1)基因空间/时间表达模式,提供有关基因功能和分类的信息;和2)专门表示基因标记,用于高通量药物或突变筛选10。
色谱探针容易降解与传统的染色体原位杂交(CISH),导致高背景噪声和非特异性信号11,12。11,WISH方法使用两个独立的双Z探针,它们被设计成杂交以靶向RNA序列。每个探针包含一个与目标RNA互补的18-25序列和14个基尾序列(概念化为Z)。目标探头用于对(双 Z)。两个尾部序列共同形成前置放大器的 28 个基本混合站点,其中包含 20 个放大器的绑定位点。放大器,反过来,包含20个结合点的标签探头,理论上可以产生高达8,000个标签为每个目标RNA序列。
这一先进技术有助于同时进行信号放大和背景抑制,实现单分子可视化,同时保持组织形态13。WISH方法的进一步修改是基于先前的研究14,包括额外的固定和DAB染色。此处提供了改进的 WISH 协议,即使目标 RNA 部分减少或降解,也可以工作。优点包括可在 24 小时内完成,无需无 RNase 条件。信号也可以通过多个目标的多个通道同时检测,结果与不同高通量自动化平台的结果一致且兼容。
动物模型的结果没有必要反映人类发生的相同现象。ENG包含两对保守的半胱氨酸,C30-C207和C53-C182,在孤儿区形成不硫化桥梁。为了进一步研究eng在HHT患者中的作用,从HHT患者衍生的iPSC的管状检测已经在没有/有eng突变的细胞中进行(Cys30Arg,C30R)15。15在久保田等人首次报告管状实验16后,该测定已经以多种方式得到开发。它已被用于识别血管生成或抗血管生成因子,定义血管生成的信号通路,并确定调节血管生成的基因17。
在提供患者衍生的iPSC-ECs之前,研究人员主要使用培养的酶来研究血管原体16。然而,对于内皮细胞来说,用病毒转导外源基因是一项技术挑战,因为ECs可以经历的通道数量有限。这是因为几乎没有足够的细胞材料从人类血管收集,无论是从手术或匹配批准的捐赠者。随着iPSC生成技术的发明,由iPSC衍生的人类EC可以可靠地用于体外实验,如前18日报道。
使用病毒转导的ECs的数量和通道可能足以信号研究,但对于功能研究,最好产生突变多能干细胞系,(或iPSCs或CRISPER/Cas9目标hESCs),然后将它们区分成ECs,用于使用管形测定19的血管生成研究。管的形成可用于评估具有突变的内皮细胞的功能。该协议还描述了α-滑动血管生成板上的管状,这是一种简单、经济、可重复的方法。
下面的协议提供了一个可靠和系统的方法,用于研究特定基因在血管形成中的作用,以及体内表达模式和体外功能定量的细节,用于模拟人类疾病。
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Protocol
所有动物实验均获得浙江大学医学院研究伦理委员会批准。
1. 全装原位杂交
- 斑马鱼线畜牧业和繁殖
- 在循环水产养殖系统中以26-28°C喂食和养殖所有成年斑马鱼,每天以14小时光/10小时暗循环。使用 AB(野生类型)斑马鱼线执行以下操作。
- 在繁殖箱底部放一层鹅卵石作为卵子的庇护所。将父母鱼的比例为2:1(即,两只雌性鱼和一只雄性鱼)放入每个盒子中。让雌性鱼产卵1天。产卵结束时,立即清除母鱼,防止它们吃鸡蛋。
- 在显微镜下使用Femto Jet注射系统将2纳克的形态和500pgmRNA注入单细胞级胚胎(endoglin-MOs序列:5'-GaATCAACTCAACAGTGTGTGTGTGTCTGAT-3';5对对照MOs序列:5'-AAACAGACATCTCTCTCT-3')。
- 在27°C下在酸性海水中孵育约48小时。
- 斑马鱼胚胎的收集与固定
- 使用塑料转移移液器从循环系统水(pH = 5.0)收集20-40斑马鱼胚胎,当它们被去移并达到特定发育期时,它们会进入1.5 mL管中。在室温 (RT) 下加入 1 mL 新鲜制备的 4% PFA 溶液。
注:胚胎选择的周期基于实验的目的。表 1显示了不同胚胎期所需的固定时间。 - 去除固定溶液,用Tween-20用磷酸盐缓冲溶液清洗胚胎(PBST,将1 mL的Tween稀释成1000 mL的PBS溶液),在RT时每次3次,每次5分钟。
- 通过孵育25%、50%和75%甲醇(在PBST中稀释)对胚胎进行5分钟的孵化,使胚胎脱水。将胚胎转移到100%甲醇5分钟,代之以新鲜的甲醇。将胚胎储存在-20°C过夜或更长时间。
- 使用塑料转移移液器从循环系统水(pH = 5.0)收集20-40斑马鱼胚胎,当它们被去移并达到特定发育期时,它们会进入1.5 mL管中。在室温 (RT) 下加入 1 mL 新鲜制备的 4% PFA 溶液。
- 水化和消化
- 水合物胚胎,用底部有尼龙网的筛子保存在100%甲醇中,在12个孔板的孔中依次清洗胚胎,每口5分钟,分别为75%、50%和25%甲醇(在PBST中稀释)。在 RT 时,使用 PBST 3x 洗涤胚胎 5 分钟。
- 在带胚胎的管中加入50μL的蛋白酶K(10mg/mL),并遵循RT表2中的消化时间。
- 在RT时,取出蛋白酶K,用PBST3x清洗胚胎5分钟。
- 探头混合和后固定
- 将根据每个基因的mRNA序列设计的探头放入40°C杂交酶系统中,直到沉淀物溶解, 这需要10分钟,将(XM_007116.7)的目标探针和另外两个重要基因混合到早期间皮内eg皮前祖形成(此处,aplnr [NM_001075105.1] 和nrp1a [NM_001040326.1])在 1.5 mL 管中以 50:1:1 的比例混合。
- 将50-100 μL的混合目标探针加入每个管与胚胎,然后在40°C孵化过夜。
注:预混合探头必须在使用前预热至40°C,并在使用前冷却至RT。 - 用Tween-20 (SSCT)制备0.2x盐酸钠柠分酸溶液:将175.3克NaCl和88克柠分酸钠溶解成1升dH2O,以获得20xSSC溶液。然后,在 dH2O 中稀释溶液 1:100 以获得 0.2 x SSCT 溶液。稀释 Tween-20 1:1000 在 0.2x SSCT 溶液中。
- 将回收的探头转移到新管中。在 RT 中,以 0.2x SSCT 溶液 3x 清洗胚胎,每次 15 分钟。回收探头可重复使用 5x-10 倍。
- 使用4%的副甲醛(PFA)在RT将胚胎固定30分钟。 在RT中用0.2x SSCT溶液3倍清洗胚胎,每次RT为15分钟。
注:Gross-Thebing等人的工作建议确定后为10分钟14分钟,但实际数量必须相应调整。在这里,我们测试了10分钟的修复后3倍,DAB死亡的敏感性受到显著影响。调查后,确保 0.5-1.0 h 的固定是最佳条件(较短的固定周期不能从目标 RNA 产生清晰的信号,并且适当的固定时间延长有助于增强信号并提供更少的背景噪声)。
- 顺序放大器和标签探头混合
- 拆下 SSCT 溶液,然后更换为 50 μL 安培 1。让胚胎在40°C下在安培1中沉淀30分钟。然后,在RT中用0.2x SSCT溶液3x清洗胚胎15分钟。
- 卸下 SSCT 解决方案并添加 50 μL 安培 2。让胚胎在40°C下稳定15分钟。然后,在RT中用0.2x SSCT溶液3x清洗胚胎15分钟。
- 拆下 SSCT 溶液,加入 50 μL 安培 3,并轻点管。然后,在40°C下孵育胚胎30分钟。在RT中,用0.2x SSCT溶液3x洗涤胚胎3x,每次15分钟。
- 取出 SSCT 溶液,按滴下加入 50 μL 安培 4,然后小心地敲击管。然后,在40°C下孵育胚胎15分钟。在RT中,用0.2x SSCT 3x清洗胚胎15分钟。
- 反染色和显微镜
- 拆下 SSCT 溶液,在每个管中添加 50 μL DAPI。在4°C下孵化胚胎过夜。
- 用PBST清洗胚胎,并在充满PBST的培养皿中,使用1%的低熔点阿加罗斯(LMP)溶液(1克LMP溶解在100 mL的dH2O)中制备。
- 使用 DAB 过氧化物酶基板套件对试样进行染色。将颜色试剂 A、B 和 C(每个 50 μL)添加到 1 mL 蒸馏水中,并混合好以获得完整的 DAB 工作液。将液体添加到试样中,盖上 10 分钟。
- 染色后使用 PBST 彻底清洗试样。
- 使用具有摄影功能的光学显微镜对样品进行成像。
注:如果以后拍摄图像,管子应用铝箔包裹,储存在4°C。
2. 管形测定
注:对来自HHT病人的iPSCs(这里,一名62岁的女性患者,22岁,胃肠道出血,肺动脉畸形,在位置c.88T>C的外头2)和一个健康的捐赠者(无英性突变)的iPSC有eng区别。
- 控制和HHT iPSC细胞培养
- 将一定量的基底膜基质(例如,Matrigel)添加到6个井细胞培养板中,以覆盖井底,并在37°C下孵育板1小时。
注:当第一次使用储存在-20°C的地下室膜基质时,孵育在冰上或无霜4°C冰箱中,直到解冻。然后,在 DMEM/F12 中稀释 1:100,然后将稀释剂分配到 200 μL 管中,每个管含有 100 μL。将管子储存在-20°C,避免反复冻结和解冻。添加稀释的基底膜基质时,不要产生气泡。加入稀释的基底膜基质后,用手轻轻摇动6孔板,使其均匀覆盖底部。 - 涂覆板后,从孔中取出用过的基底膜基质溶液。然后,在每个井中加入 2 mL mTeSR1 介质,并将从最后一个通道中收获的 iPSC 以大约每口 1 x 106的工程。
- 将一定量的基底膜基质(例如,Matrigel)添加到6个井细胞培养板中,以覆盖井底,并在37°C下孵育板1小时。
- 从 iPSC 生成和扩展 EC
- 经过大约 4 天的 iPSC 培养,使用带有活动素 A (25 ng/mL)、BMP4 (30 ng/mL)、VEGF165 (50 ng/mL) 和 CHIR99021 (1.5 μM) 的贝尔介质交换培养介质。将细胞生长3天,以产生中皮细胞。
- 用VEGF(50纳克/mL)和SB431542(10μM)补充的BEL介质替换步骤2.2.1中描述的介质,以扩大血管酶。用相同的介质和培养处理细胞3-4天。
- 使用CD31-dyna珠来纯化成熟的血管电体:参考CD31-dynaads试剂盒中的说明,该试剂盒将人类CD31抗体与磁珠连接起来,将CD31分子结合在ECs上表达的CD31分子,然后通过洗脱缓冲液收集CD31阳性细胞。维护和扩展含有VEGF165(30纳克/mL)、bFGF(30纳克/mL)和FBS(1%)的EC-SFM介质中的纯化EC。
- 在母体涂层板和显微镜上电镀内皮细胞
- 每口加入10μL的基底膜基质,涂上血管生成板(参见材料表),并在37°C下孵育30分钟。
- 在检查具有免疫荧光染色的内皮标记CD31和VE-cadherin后,收获内皮细胞,并通过反复移液在内皮生长介质2中重新悬浮它们。每口将50μL的细胞悬浮液(2 x 105细胞/mL)添加到凝固的基质上,并在37°C下孵育3-5小时细胞。
注:在管形成实验之前,应检查内皮标记,以确保功能内皮细胞的正确表型。每口井1 x 104细胞是管形成的理想数字。细胞过多或太少不利于管的形成。从盘子的侧面加入细胞,不要触摸基底膜基质。在高放大率场中使用光学显微镜检查细胞并拍照。
- 管状的定量结果
- 使用高分辨率显微镜观察结果,并为每个组至少拍摄 10 个区域,以获得可靠的数据统计数据。
- 检查内皮管的形成:通过检查管总长度、管数和分支点来估计管的形成程度。使用 ImageJ 软件评估和计数分支的数量和长度。
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Representative Results
整个原位杂交基于类似于荧光共振能量传递的原理。它旨在提高斑马鱼ISH的灵敏度和特异性,并在不影响背景信号的情况下放大目标特异性信号。
在24个hpf斑马鱼胚胎中,在后侧基静脉(PCV)、分段血管(ISV)和血岛3中高度表达。在传统的色原原位杂交(CISH)中,很难控制染色时间,在一些地区出现非阳性信号,如蛋黄囊(图1A)。为了研究eng在早期血管发育中的作用,使用了造血内皮标记(aplnra)和另一个内皮祖标记(nrp1a),以检查哪种类型的内皮瘤受到eng沉默20的影响。在24个hpf胚胎中,阿普拉和nrp1a的表达很弱。与CISH相比,在WISH(图1B)中,在英击倒后,两个基因的微弱信号在尾部区域得到了明显证明。在HHT动物模型中,eng RNA的敲击导致两种内皮细胞标记基因表达的表达减少。
在进行分化iPSCs实验之前,这些细胞被确定并确认为ECs。形态学上,它们以鹅卵石形状的形式出现。内皮细胞表面分子标记CD31、CD146、VE-cadherin和vWF的表达与IF染色21得到证实。使用CD31进行基于磁性的隔离后,按如下所述进行功能测定。
在这里,管的形成测定是使用eng突变和控制iPSC衍生的内皮细胞进行的。根据管的数量、分支和长度进行统计分析。还介绍了一种基于先前工作3,血管生成点,以反映内皮细胞的管形成的新参数。最终,发现英突变内皮细胞形成的分支比对照内皮细胞少,而在血管内皮生长因子(VEGF)刺激后,恩突变体内皮细胞中的分支显著增加(图2A,B)。eng的突变导致血管管的形成缺陷。
图1:恩多林击倒减少了内皮标记的表达。(A) CISH 和 WISH 被执行以确定在 24 hpf 胚胎 (n > 30) 中 endoglin 的表达。红色框表示放大的区域。刻度杆 = 200 μm. (B) aplnra和nrp1a表达由 WISH 在控制-MO 和eng-MO组的 24 hpf 斑马鱼胚胎中表达。红色箭头表示这些基因表达显著减少的区域。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2:管状的突变体和控制iPSC-ECs。(A) 四组形成的管状物,包括对照组、对照组 + VEGF(控制内皮细胞 = 30 ng/mL VEGF)、eng 突变(英语突变体内皮细胞)组,以及eng突变体 + VEGF(英语突变体内皮细胞 = 30 ng/mL VEGF) 组。 eng在3小时刻度杆= 100 μm(B) 显示管状形成定量结果后,对管形进行评估和拍摄。在覆盖区域,通过 Image J 计算分支数及其管长,误差条表示三个独立实验中平均值的 SD。当 _p < 0.05 时,P 的值被视为具有统计显著性。请点击此处查看此图形的较大版本。
胚胎期 | 固定时间 |
4 个单元到 8 hpf | 4 小时 |
8 hpf 到 24 hpf | 1 小时 |
24 hpf 到 4 dpf | 30分钟 |
表1:不同胚胎阶段所需的固定时间。
胚胎期 | 消化时间 |
4 个单元到 8 hpf | 2分钟 |
8 hpf 到 24 hpf | 5分钟 |
24 hpf 到 4 dpf | 10分钟 |
表2:不同胚胎阶段所需的消化时间。
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Discussion
该协议在HHT患者的iPSC-ECs上应用了改进的全位RNA分析平台,用于斑马鱼和管状检测。传统的ISH方法需要更长的实验周期和额外的实验步骤。该协议有一些重要的改进,分别使用独立双Z探头和iPSC从HHT患者身上获得,分别应用于WISH测定和管状。与传统 ISH 相比,这些改进对于提高检测灵敏度至关重要。独特的设计探头和目标信号放大允许检测很少表达的转录(aplnra是24个hpf胚胎中表达不良的基因)。一个修改是探测混合后的额外固定。额外的固定可以增强探头和脚本的组合。DAB 染色也应用而不是荧光染色,因为发现在某些低丰度基因中很难进行荧光染色。然后,iPSC用于血管生成测定,这增加了这项工作的意义和临床相关性。iPSC 的生成需要严格的文化条件,并且代表协议的限制。
必须突出显示一些关键步骤。在WISH分析中,斑马鱼胚胎的消化时间应严格按照文本进行。较短的消化时间不能保证探头与笔录成功结合。相反,延长消化时间会破坏胚胎的完整性。在管的形成实验中,成像正时应得到很好的控制。一般来说,内皮细胞将在12小时内成为管,但管状结构在24小时后容易分解。细胞数对管的形成也很重要,因为细胞密度过高或过低会导致管的形成失败。如果难以诱导内皮细胞形成管状,则有助于将VEGF等生长因子添加到培养介质中,作为一种正控制,以测试EC形成管状结构的能力。
综上所述,改进后的WISH方法被认为是实验室工作流程的一种优势技术。最近,我们的研究小组开始在临床样本中测试这种测定。考虑到比传统方法所观察到的灵敏度更高、检测效率更高,这种改进的WISH方法为开发和实施基于RNA的分子诊断22带来了重大前景。
使用患者iPSC-ECs的管状测定性能允许确认动物研究的结果,并识别基因中单核苷酸多态性引起的疾病突变。这些方法的结合澄清了eng在血管形成中的作用,并在心血管细胞治疗患者iPSC-ECs的基因矫正中具有潜力。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家干细胞转化研究重点研究发展计划(资助编号2016YFA0102300(致杨俊)的资助;中国自然科学基金[资助号81870051,81670054(给杨俊)];CAMS医学创新基金[授予编号2016-I2M-4-003(致杨俊)];PUMC青年发现和中央大学基础研究基金[授予编号2017310013(方周)]。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
µ-Slide Angiogenesis | ibidi | 81506 | Cell culture |
Amp 1-FL | ACD | SDS 320852 | Signal Amplification |
Amp 2-FL | ACD | SDS 320853 | Signal Amplification |
Amp 3-FL | ACD | SDS 320854 | Signal Amplification |
Amp 4 Alt B-FL | ACD | SDS 320856 | Signal Amplification |
Corning Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Growth factor-reduced Matrigel |
DEPC | Sigma | D5758 | RNAase-free Water |
Human Endothelial-SFM | Thermofisher | 11111044 | Cell culture |
Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed embryos |
Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed Cells |
Protease K | ACD | SDS 322337 | Digest tissue |
Sodium Citrate | Sigma | 6132-04-3 | SSCT solution: Wash Buffer |
VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | Growth factor |
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