Summary
Het gepresenteerde protocol maakt gebruik van flow cytometrie om het aantal vermenigvuldigende en dode cellen in gekweekte muisenteroïden te kwantificeren. Deze methode is nuttig om de effecten van medicamenteuze behandeling op organoïde proliferatie en overleving te evalueren.
Abstract
Het darmepitheel fungeert als een barrière die voorkomt dat de inhoud van de armatuur, zoals pathogene microbiota en toxines, de rest van het lichaam binnendringt. Epitheliale barrière functie vereist de integriteit van darmepitheelcellen. Terwijl epitheelcelproliferatie een continue laag cellen onderhoudt die een barrière vormt, leidt epitheelschade tot barrièredisfunctie. Als gevolg hiervan kan de luminaalinhoud via een onbeperkt pad over de darmbarrière lopen. Disfunctie van de darmbarrière is geassocieerd met veel darmziekten, zoals inflammatoire darmziekte. Geïsoleerde muis darmcrypten kunnen worden gekweekt en onderhouden als crypt-villus-achtige structuren, die worden genoemd intestinale organoïden of "enteroïden". Enteroïden zijn ideaal om de proliferatie en celdood van darmepitheelcellen in vitro te bestuderen. In dit protocol beschrijven we een eenvoudige methode om het aantal proliferative en dode cellen in gekweekte enteroïden te kwantificeren. 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) en propidiumjodide worden gebruikt om woekerende en dode cellen in enteroïden te etiketteren, en het aandeel van vermenigvuldigende en dode cellen wordt vervolgens geanalyseerd door stroomcytometrie. Dit is een nuttig hulpmiddel om de effecten van medicamenteuze behandeling op darmepitheliale celproliferatie en celoverleving te testen.
Introduction
Een fundamentele functie van darmepitheelcellen is het beschermen van de intrede van luminale inhoud zoals pathogene bacteriën en toxines1,2. Om een dergelijke functie uit te voeren, vermenigvuldigen darmstamcellen zich voortdurend en onderscheiden ze zich in een verscheidenheid van epitheelcellen, waaronder enterocyten en secretoire cellen, die een barrière vormen door het vormen van nauwe verbindingen3. De snelle vernieuwing van darmepitheelcellen vereist een strikte coördinatie van celproliferatie, celdifferentiatie en celdood4,5. Verminderde celproliferatie of overmatige celdood leidt tot epitheelschade en gecompromitteerde barrièrefunctie1,6. Disfunctie van de darmbarrière is geassocieerd met inflammatoire darmziekten7,8.
Een methode om darmcrypten te kweken is eerder ontwikkeld. Met behulp van deze techniek groeien geïsoleerde muiscrypten uit tot darmorganoïden (enteroïden), die crypte-villusachtige structuren hebben en alle darmepitheelcellijn9,10bevatten. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) is een thymidine analoog die in staat is om thymine (T) te vervangen in DNA dat replicatie ondergaat tijdens celproliferatie. De proliferative cellen kunnen snel en nauwkeurig worden gelabeld door EdU kleuring. Propidiumjodide (PI) is een analoog van ethidiumbromide die rode fluorescentie vrijgeeft bij het inbrengen in dubbelstrengs DNA. PI detecteert specifiek dode cellen, omdat het alleen door het beschadigde celmembraan gaat.
In dit protocol beschrijven we eerst hoe crypten uit de dunne darm van murine te isoleren en ze vervolgens te kweken als enteroïden in vitro. Vervolgens beschrijven we hoe de proliferative en dode cellen in enteroïden te analyseren door EdU en PI integratie en flow cytometrie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol werd goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU) van soochow University.
1. Intestinale isolatie en cultuur
- Isolatie van darmcrypten en enteroïdecultuur
- Euthanaser een 8 weken oude wild-type muis met CO 2-inademing. Gebruik weefseltangen en fijne irisschaar om ongeveer 8 cm ileum uit te ontleden.
- Spoel uit met behulp van een spuit met gavage voeding naald met ongeveer 40 mL van ijskoude Dulbecco fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS), dan in de lengte gesneden met een schaar en open het ileum.
- Snijd het ileum in kleine (0,5−1,0 cm) stukken. Plaats de stukken in 5 mL steriele ijskoude DPBS in een conische buis van 15 mL en rock vervolgens 5 min op ijs.
- Gebruik een pipetcontroller om de DPBS aan te zuigen en te vervangen door 10 mL koude buffer 1 (2 mM EDTA in DPBS). Rock voor 30 min op ijs.
- Gebruik de pipetcontroller om buffer 1 aan te zuigen en te vervangen door 10 mL koude buffer 2 (54,9 mM D-sorbitol, 43,4 mM sacharose in DPBS). Schud 2−3 min met de hand (~80 shakes/min).
- Neem een 20 μL druppel buffer 2 inhoud na het schudden en inspecteren onder een microscoop.
- Filter buffer 2-inhoud met een steriele celzeef van 70 μm en verzamel vervolgens de gefilterde buffer met een conische buis van 50 mL.
- Pipetteer 20 μL filtraat op de glijbaan om de crypten te tellen. Breng een voldoende volume buffer 2 van stap 1.1.7 om ervoor te zorgen dat er ~ 500 crypten / goed.
- Draai naar beneden bij 150 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Zodra het spinnen klaar is, zuigt voorzichtig de supernatant aan.
- Schorscrypten in 50 μL keldermembraanmatrix (bijvoorbeeld Matrigel) per 500 crypten, pipeter op en neer (voorzichtig zijn om bellen te vermijden), plaats dan een 50 μL druppel van keldermembraanmatrix/cryptemix in het midden van één put in een 24-putplaat. Incubeer gedurende 30 min bij 37 °C om keldermembraanmatrix te polymeriseren.
- Voeg na 30 min polymerisatie voorzichtig 600 μL minigut media toe (geavanceerde Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium [DMEM]/F12, 2 mM L-alanine-L-glutamine, pen/strep [100 units/mL], 10 mM Hepes, N2-supplement [1:100], B27 supplement [1:50] met epidermale groeifactor [EGF; 50 ng/mL], Noggin [100 ng/mL], R-spondin [500 ng/mL], en Y27632 [10 μM]) aan elke put, dan de plaat terug te geven aan de 37 °C incubator. Observeer elke dag onder een microscoop en verander de media elke 2−3 dagen.
- Enteroid passaging
OPMERKING: Voor lange culturen moeten enteroïden ongeveer elke week worden gesplitst.- Om de enteroïden te passeren, plaats je de weefselkweekplaat op ijs. Aanzuigen van de media en voeg 1 mL koude DPBS aan elke put. Gebruik een P1000 tip om op en neer te pipeteren totdat er geen solide kelder membraan matrix brokken blijven.
- Ga één keer op en neer door een insulinespuit van 1 mL (27 G) en in een conische buis van 15 mL. Draai 5 min bij 150 x g bij 4 °C.
- Gebruik pipet om DPBS te verwijderen. Resuspend in 50 μL van kelder membraan matrix / goed.
- Plaats de plaat in een 37 °C incubator gedurende 30 min om keldermembraanmatrix te laten polymeriseren. Overlay elk goed met 600 μL enr media (minigut media, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 500 ng/mL R-spondin), dan terug de plaat naar de incubator.
2. Flow Cytometry Analyse van EdU-positieve cellen in Enteroïden
OPMERKING: Figuur 1 toont de workflow voor flow cytometrieanalyse van EdU-positieve cellen in enteroïden.
- Incubatie van enteroïden met EdU
- Kweek enteroïden van stap 1.2.4 gedurende 5-7 dagen. Passage enteroïden in een nieuwe 24 putplaat in een splitsingsverhouding van 1:2. Voeg 600 μL ENR medium toe aan elke put. Incubeer enteroïden gedurende 4−5 dagen in een 37 °C incubator.
- Stel de controlegroep (onbehandelde enteroïden) en experimentele groep (enteroïden behandeld met 5 ng/mL interleukine 22 [IL-22]). Bereid ten minste drie replica's voor elke groep.
- Voeg EdU toe aan het ENR-medium om EdU-medium voor te bereiden met een concentratie van 50 μM. Voeg 600 μL EdU medium toe aan elke put en broed gedurende 2 uur in een 37 °C incubator. Stel een put van enteroïden zonder EdU behandeling als een negatieve controle voor achtergrond aftrekken.
- Oogsten van enteroïden uit keldermembraanmatrix
- Gebruik een pipetcontroller om EdU medium aan te zuigen en 1x wassen met DPBS. Voeg 1 mL DPBS toe.
- Gebruik P1000 pipet tip en pipet op en neer totdat er geen solide kelder membraan matrix brokken blijven. Breng over op een 15 mL-buis en draai op 300 x g voor 5 min. Gooi de supernatant weg.
- Voeg 500 μL cel-dissociatieenzymen(Tabel van materialen)toe en broed gedurende 15 min bij 37 °C. Gebruik P200 pipet tip en pipet op en neer om enteroïden te breken in enkele cellen.
- Voeg 3 mL DMEM-medium toe dat 10% foetaal runderserum (FBS) bevat en herhaaldelijk pipett met een P1000 pipettip.
- Draai naar beneden op 300 x g voor 5 min en aanzuigen van de supernatant medium. De cellen opnieuw opschorten met 1 mL DPBS.
- Fixatie en permeabilisatie van cellen
- Breng de celvering over op een 1,5 mL-buis, draai op 300 x g voor 5 min en gooi de supernatant weg.
- Hersuspendeer cellen met 1 mL van 4% paraformaldehyde (PFA), bevestig 15 min bij kamertemperatuur (RT) en spin naar beneden bij 300 x g voor 5 min. Aanzuigen van de supernatant met een pipet tip, was 1x met DPBS, en spin naar beneden om de supernatant te verwijderen.
- Cellen opnieuw opschorten met 1 mL van 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve stof. Incubeer voor 10 min bij RT.
- Draai naar beneden op 300 x g voor 5 min en aanzuigen de supernatant. Was 1x met DPBS en draai naar beneden om de supernatant te verwijderen.
- Detectie van EDe
- Bereid voorraadoplossingen voor elk onderdeel vooraf: 1) werkoplossing van de Alexa Fluor azide, 2) werkoplossing van 1x EdU-reactiebuffer en 3) 10x voorraadoplossing van EdU-bufferadditief.
- Bereid 1x EdU buffer additief door verdunning van de 10x oplossing 1:10 in gedeïoniseerd water. Bereid deze oplossing vers voor.
- Bereid reactiecocktail volgens tabel 1.
LET OP: Voeg de ingrediënten toe in de volgorde die in de tabel wordt vermeld. Gebruik de reactiecocktail binnen 15 min na bereiding. - Voeg 100 μL reactiecocktails toe aan elke 1,5 mL buis. Resuspend de cellen, beschermen tegen licht, uitbroeden voor 30 min bij RT.
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min en zuig de reactieoplossing voorzichtig aan met pipettip.
- Voeg 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve penetrant toe aan elke buis om 1x te wassen bij RT. Centrifuge op 300 x g voor 5 min, aanzuigen van de supernatant met pipet tip zachtjes, en opnieuw de cellen in 1 mL van DPBS.
- Analyse van cellen per stroomcytometrie
- Filtreer de opnieuw opgehangen cellen met een zeef van 40 μm en verzamel vervolgens de gefilterde cellen met een conische buis van 15 mL. Voer FACS on-machine detectie zo snel mogelijk uit.
OPMERKING: Als de omstandigheden beperkt zijn, moeten de met cellen bevlekte monsters in het donker bij 4 °C worden opgeslagen en binnen 3 dagen worden getest. - Selecteer het juiste kanaal (volgens het type Alexa Fluor azide in de EdU kit; hier, rood kanaal) en spanning (hier, ~150-350 V) voor flow cytometrie analyse.
- Gating strategie
- Teken een FSC-A (x-as) vs. SSC-A (y-as) pseudocolor plot en verdeel de meeste cellen naar het zichtbare bereik van de stip kaart door het aanpassen van de spanning. Selecteer de celpopulatie (R1) en sluit het celpuin in de linkerbenedenhoek uit.
- Stel vanuit de R1-celpopulatie een FSC-A (x-as) vs. FSC-H (y-axis) pseudocolor plot, en stel de poort om enkele cellen (R2) te selecteren om celklontjes uit te sluiten.
- Van de R2 celpopulatie, vaststellen van de fluorescentie intensiteit (x-as) vs. celnummer (y-as) plot, en gebruik de negatieve controle om de poort in te stellen. Het gebied van het tl-signaal is een positief celgebied (R3). Vergelijk de verhouding van EdU-positieve cellen (R3) tussen de experimentele en controlegroepen.
- Filtreer de opnieuw opgehangen cellen met een zeef van 40 μm en verzamel vervolgens de gefilterde cellen met een conische buis van 15 mL. Voer FACS on-machine detectie zo snel mogelijk uit.
3. Flow Cytometry Analyse van PI-positieve cellen in Enteroïden
OPMERKING: Figuur 2 toont de workflow voor flow cytometrieanalyse van PI-positieve cellen in enteroïden.
- Incubatie van enteroïde cellen met PI
- Kweek enteroïden van stap 1.2.4 gedurende 5-7 dagen. Passage enteroïden in een nieuwe 24 putplaat in een splitsingsverhouding van 1:2. Voeg 600 μL ENR medium toe aan elke put. Incubeer enteroïden gedurende 4−5 dagen in een 37 °C incubator.
- Stel de controlegroep (onbehandeld) en experimentele groep (IL-22 behandeld) in met ten minste drie replicaties voor elke groep.
- Voeg PI toe aan het ENR-medium om PI-medium voor te bereiden met een concentratie van 3 μM.
- Voeg 600 μL PI medium toe aan elke put en incubeer gedurende 30 min in een 37 °C incubator. Stel een put van enteroïden zonder PI behandeling als een negatieve controle voor achtergrond aftrekken.
- Oogst enteroïden uit de matrix van het keldermembraan na de stappen 2.2.1−2.2.5.
- Analyse van cellen per stroomcytometrie
- Filtreer de opnieuw opgehangen cellen met een zeef van 40 μm en verzamel de gefilterde cellen met een conische buis van 15 mL.
- Voer FACS on-machine detectie zo snel mogelijk uit.
OPMERKING: Als de omstandigheden beperkt zijn, moeten de met cellen bevlekte monsters in het donker bij 4 °C worden opgeslagen en binnen 3 dagen worden getest. - Selecteer het juiste kanaal (hier, rood kanaal) en spanning (hier, ~150–350 V) voor stroomcytometrieanalyse.
- Gebruik dezelfde gatingstrategie als beschreven in punt 2.5.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kleine darmcrypten werden geïsoleerd en gekweekt als enteroïden in kelder membraan matrix. Enteroïden begonnen knoppen te vormen 2 dagen na isolatie. Op dag 6 hadden enteroïden veel knoppen met veel puin (dode cellen) in het lumen. Enteroïden waren klaar om te worden doorgegeven in dit stadium (figuur 3).
Talrijke studies hebben aangetoond dat ontstekingscytokinen essentieel zijn voor het behoud van darmepitheelhomeostase. Abnormale expressie van ontstekingscytokinen is nauw verbonden met het optreden van inflammatoire darmziekten11. Zo toonde onze vorige studie aan dat IL-22 de proliferatie van transitversterkende cellen bevordert, maar ook Lgr5+ stamcellen12uitput.
Enteroïden werden 3 dagen behandeld met IL-22, waarna het synthetische DNA werd gelabeld met EdU om celproliferatie aan te geven. IL-22-behandelde enteroïden vertoonden een toename van het aantal EdU+ cellen(figuur 4A). IL-22 verhoogde de woekerende cellen van 40,1% naar 83,5% zoals geanalyseerd door flow cytometrie (figuur 4B). IL-22 behandeling verhoogde ook de celdood in enteroïden, aangegeven door PI kleuring(figuur 5A). IL-22 verhoogde dode cellen van 4,9% naar 16,2% zoals geanalyseerd door flow cytometrie (figuur 5B).
Figuur 1: Werkstroomdiagram voor stroomcytometrieanalyse van EdU-positieve cellen in enteroïden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Werkstroomdiagram voor stroomcytometrieanalyse van PI-positieve cellen in enteroïden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Brightfield beelden van enteroïden op 2, 4 en 6 dagen post-crypt isolatie. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: IL-22 verhoogt de proliferatie van enteroïden. (A) Enteroids werden gedurende 3 dagen in medium gekweekt zonder of met IL-22 (5 ng/mL) en bebroed met EdU (rood) gedurende 1 uur. Schaalbalk = 100 μm. (B) Stroom cytometrie gegevens van enteroïden gekweekt zonder (links) of met (rechts) IL-22. De gegevens zijn representatief voor drie afzonderlijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: IL-22 bevordert celsterfte in enteroïden. (A) Enteroïden werden gekweekt in medium zonder of met IL-22 (5 ng/ mL) gedurende 3 dagen en bevlekt met propidiumjodide (rood). Schaalbalk = 100 μm. (B) Stroom cytometrie gegevens van enteroïden gekweekt zonder (links) of met (rechts) IL-22. De gegevens zijn representatief voor drie afzonderlijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Reactiecomponenten | Aantal putten van 24-well platen | |||||
| 1 | 2 | 5 | 10 | 20 | 50 | |
| 1x Reactiebuffer | 86 μL | 172 μL | 430 μL | 860 μL | 1,72 μL | 4,3 μL |
| CuSO4 | 4 μL | 8 μL | 20 μL | 40 μL | 80 μL | 200 μL |
| Alexa Fluor azide | 0,25 μL | 0,5 μL | 1,25 μL | 2,5 μL | 5 μL | 12,5 μL |
| Reactiebufferadditief | 10 μL | 20 μL | 50 μL | 100 μL | 200 μL | 500 μL |
| Totaal volume | 100 μL | 200 μL | 500 μL | 1 μL | 2 μL | 5 μL |
| LET OP: Voeg de ingrediënten toe in de volgorde die in de tabel wordt vermeld. | ||||||
Tabel 1: EdU reactiecocktail.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor de cultuur van enteroïden in vitro en kwantificering van EdU- en PI-positieve cellen in de enteroïden door stroomcytometrie. Er zijn verschillende voordelen van deze strategie. Ten eerste wordt EdU-etikettering gebruikt om woekercellen in enteroïden te detecteren. In vergelijking met traditionele BrdU-test is de EdU-etiketteringsmethode sneller, gevoeliger en nauwkeuriger. EdU is zeer vergelijkbaar met thymine (T), die thymine vervangt in DNA-synthese tijdens de celdeling. In vergelijking met het BrdU-antilichaam is EdU gemakkelijker te verspreiden in de cel en de detectie van EdU vereist geen DNA-denaturatie en een antigeen-antilichaamreactie. Ten tweede kan flow cytometrieanalyse de vermenigvuldigende (EdU+) en dode (PI+)cellen in enteroïden snel en nauwkeurig kwantificeren.
Om de hele procedure met succes uit te voeren, zijn er kritische aspecten die in overweging moeten worden genomen. Ten eerste is het belangrijk om enteroïden onder voldoende omstandigheden te kweken. Goed gekweekte enteroïden moeten veel knoppen hebben, die proliferative cellen bevatten. Ten tweede is het belangrijk om enteroïden tijdig te splitsen. Puin verzameld in het lumen bevat dode cellen, die kunnen worden gekleurd met PI. Dit is schadelijk voor de volgende flow cytometrie analyse. Ten derde kunnen cellen door de vele stappen (d.w.z. celkleuring, celfixatie, membraanbreuk en centrifugeren) gemakkelijk verloren gaan tijdens de procedure. Het is dus belangrijk om voldoende enteroïden te verzamelen. Het is belangrijk om 2−3 putten (in een 24 putplaat) van enteroïden te combineren voor fixatie. Ten slotte is het van cruciaal belang om ingrediënten toe te voegen aan de buffer om EdU te detecteren, anders zal de reactie niet optimaal verlopen.
Samengevat, het protocol details stappen voor het kweken van muis enteroïden in vitro en de kwantificering van vermenigvuldigende en dode cellen door stroom cytometrie. Enteroïden zijn nuttige hulpmiddelen voor ziektemodellering en therapeutische medicijnontdekking. Dit protocol helpt bij het verkennen van de effecten van ontstekingscytokines, ziekteverwekker en geneesmiddelen op celproliferatie en celoverleving in enteroïde kweekmodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (31971062, 31900326 en 31601022), The Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20190043, BK20180838), Research Fund of State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Nanjing University (KF-GN-202004). De Natural Science Foundation van de Jiangsu Higher Education Institutions of China (19KJB320003), The Livelihood and Technology Program of Suzhou City (SYS2019030), en The Research Innovation Program for College Graduates of Jiangsu Province (KYCX19-1981) . Dit werk wordt ook ondersteund door Tang Scholar van Soochow University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 24-well plate | Nunc | 142475 | |
| 40 mm sterile cell strainer | BD | 352340 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 70 mm sterile cell strainer | BD | 352350 | |
| Advanced DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 Supplement | GIBCO | 17504044 | |
| Buffer 1 | 2 mM EDTA in DPBS | ||
| Buffer 2 | 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS | ||
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Cell-dissociation enzymes (TrypLE) | Life technologies | 12605-010 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life technologies | C10639 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | 14190144 | |
| D-sorbitol | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR media | Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Fine Iris Scissors | Tansoole | 2037454 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | |
| Goat Serum | Life technologies | 16210-064 | |
| HDMEM | Hyclone | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| Minigut media | Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50) | ||
| N2 supplement | R&D | AR009 | |
| Nonionic surfactant (Triton X) | BBI | TB0198-500ML | |
| Operating Scissor (12.5 cm) | Tansoole | 2025785 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | sigma | 158127-500g | |
| Penn/Strep | Invitrogen | 15140-148 | |
| Phase contrast microscope | Nikon | TS1000 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| Recombinant EGF | PeproTech | 315-09 | |
| Recombinant Mouse Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | |
| Recombinant Murine IL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| Sucrose | BBI | SB0498 | |
| Tissue Forceps | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
References
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).
- Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
- Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
- Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut. Frontiers in Immunology. 10, 1094 (2019).
- Li, B. R., et al. In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
- Graham, W. V., et al. Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis. Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease. Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).
- Zha, J. M., et al. Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).
