在没有序列特异性引录的情况下,RNA发夹和环可作为逆转录(RT)的引种,干扰重叠反义转录本的研究。我们已经开发出一种能够识别股特异性RNA的技术,并用它来研究HIV-1反义蛋白ASP。
在逆转录病毒中,在人体免疫缺陷病毒1型(HIV-1)和人类T-淋巴病毒1(HTLV-1)中都描述了反义转录。在HIV-1中,反义蛋白ASP基因位于env的负链上,在读帧-2中,跨越连接gp120/gp41。在感向上,ASP 开放读取帧的 3′ 端与 gp120 超可变区域 V4 和 V5 重叠。ASP RNA的研究因一种称为RT自吸的现象而受阻,即RNA二级结构能够在没有特异性引物的情况下对RT进行质感,从而产生非特异性cDNA。在RT反应中结合高RNA变性与生物素化逆转引物,结合将cDNA亲和纯化到链球菌素涂层磁珠上,使我们能够选择性地扩增从HIV-1感染者中提取的CD4+T细胞中的ASP RNA。我们的方法成本相对较低,操作简单,可靠性高,易于重现。在这方面,它不仅在HIV-1中,而且在其他生物系统中,是研究反义转录的有力工具。
反义蛋白(ASP)基因是一个开放阅读框架(ORF),位于人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)包络(env)基因的负链上,跨越结gp120/gp411。过去30年来,有多份报告显示,HIV ASP基因确实被转录和翻译了2,3,4,5,6,7,8,9。虽然ASP反义转录本在体外已经完全特征化,但直到最近,关于ASPRNA在患者中实际产生的信息仍然缺失。
ASP 的顺序是反向的,并且与 env 互补。这是尝试检测 ASP 脚本时的主要障碍。标准逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法使用基因特异性反义引物合成正确极性的互补DNA(cDNA)。然而,这种方法不允许确定初始RNA模板的方向(感觉或反义),因为RNA发夹或环可以在没有引源10的情况下在两个方向上对RT进行素脚,这种现象称为RT自吸。大多数ASP调查员回避了RT自吸问题,使用带有与HIV-11、12无关的序列标记的引注。然而,这一战略并没有消除这一现象的发生,并可能导致非特异性cDNA可能带入PCR11。
我们最近开发了一种用于反义RNA研究的新型股特异性RT-PCR测定,并用它来检测6名艾滋病毒感染者的ASPRNA,如表1所示。下面描述的程序以前曾由安东尼奥·曼卡雷拉等人发表。在我们的协议中,我们避免通过双种方法生产非特定 cDNA。首先,我们在高温(94°C)下变性RNA来消除RNA二次结构;其次,我们使用生物素化ASP特异性底漆逆转转录ASPRNA,并亲和-纯化产生的cDNA。通过这种方法,我们能够仅扩增我们的目标cDNA,因为其他非特异性RT产品要么被阻止生成(RNA的高温变性),要么在PCR(亲和纯化)之前消除。
在本报告中,我们描述了一种链特异性RT测定,用于检测从HIV-1感染者中分离的CD4+T细胞中的ASPRNA。RT 期间发生非特异性吸注会妨碍具有正确极性的 RNA 转录本的检测,从而导致对结果的误解。以前的研究小组已经制定了几种策略,旨在防止在RT反应期间与引物无关的cDNA合成。在3’末端标记反向引种与与HIV无关的序列已被证明能有效地实现股特异性扩增6,8,9。<sup class="xref…
The authors have nothing to disclose.
我们感谢帕特里齐亚·阿梅利奥、亚历山德拉·诺托、克雷格·芬威克和马蒂厄·佩雷奥随时可以讨论我们的工作,并感谢艾滋病免疫机制实验室的所有人提供的宝贵技术援助。我们还要感谢VSB联合公司的约翰和亚伦·韦德尔,他们贡献了优秀的艺术品。最后,许多特别感谢所有的病人,没有他们,这项工作是不可能的。这项工作没有得到任何供资机构的具体赠款。
BD LSR II | Becton Dickinson | ||
BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4337450 | |
dNTP Set (100 mM) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 10297018 | |
Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19052 | |
Fetal Bovine Serum | Biowest | S1010-500 | |
Fixation/Permeabilization Solution Kit | Becton Dickinson | 554714 | |
HIV Gag p24 flow cytometry antibody – Kc57-FITC | Beckman Coulter | 6604665 | |
Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-743 | |
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | 61764-1MG | |
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | L34967 | |
Mouse Anti-Human CD28 | Becton Dickinson | 55725 | |
Mouse Anti-Human CD3 | Becton Dickinson | 55329 | |
Primers and Probes | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00-H | |
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11304011 | |
Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 18080044 | |
TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4369016 | |
TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | K450001 | |
TURBO DNase (2 U/µL) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4375786 |