Separazione dell'involucro cellulare per i batteri Gram-negativi in frazioni di membrana interne ed esterne con regolazioni tecniche per Acinetobacter baumannii
Summary
I batteri Gram-negativi producono due membrane selvadenti spazialmente. La membrana esterna è partizionata dalla membrana interna da un periplasma e da uno strato peptidoglycan. La capacità di isolare i doppi bistrati di questi microbi è stata fondamentale per comprendere la loro fisiologia e patogenesi.
Abstract
Questo metodo funziona partizionando l’involucro di batteri Gram-negativi in frazioni di membrana totale, interna ed esterna (OM) e si conclude con saggi per valutare la purezza dei bistrati. L’OM ha una densità complessiva aumentata rispetto alla membrana interna, in gran parte a causa della presenza di lipooligosaccori (LOS) e lipopolysaccharides (LPS) all’interno del volantino esterno. Le molecole LOS e LPS sono glicolipidi anfipatici che hanno una struttura simile, che consiste in un lipidico-Asaccharolipid e nucleo-oligosaccharide substituente. Tuttavia, solo le molecole LPS sono decorate con una terza sottounità nota come O-polysaccharide, o O-antigen. Il tipo e la quantità di glicolididi presenti influiranno sulla densità OM di un organismo. Pertanto, abbiamo testato se le membrane di batteri con contenuto glicolico vario potrebbero essere isolate in modo simile utilizzando la nostra tecnica. Per gli organismi che producono LPS, Salmonella enterica serovar Typhimurium e Escherichia coli, le membrane erano facilmente isolate e la moiety LPS O-antigene non ha influenzato il partizionamento del bistrato. Acinetobacter baumannii produce molecole LOS, che hanno una massa simile alle molecole LPS carenti di O-antigen; tuttavia, le membrane di questi microbi non potevano inizialmente essere separate. Abbiamo ragionato sul fatto che l’OM di A. baumannii era meno denso di quello di Enterobacteriaceae, quindi il gradiente di saccarosio è stato regolato e le membrane sono state isolate. La tecnica può quindi essere adattata e modificata per l’uso con altri organismi.
Introduction
I batteri Gram-negativi producono due membrane separate da uno spazio periplasmico e da una parete cellulare peptidoglycan1. La membrana interna (IM) racchiude il citosol ed è un bistrato simmetrico di fosfolipidi. Peptidoglycan protegge dalla pressione del turgor e fornisce al batterio una forma cellulare, ed è attaccato alla membrana esterna (OM) da lipoproteine2,3. L’OM circonda il periplasma ed è prevalentemente asimmetrico. Il volantino interno è costituito da fosfolipidi e il volantino esterno è costituito da glicolipidi noti come lipooligosaccori (LOS) o lipopoliosaccori (LPS)4,5. L’asimmetria lipidica e la biochimica delle molecole LOS/LPS nel foglio esterno conferiscono proprietà di barriera alla superficie cellulare che proteggono il batterio dai pericoli nel suo ambiente6,7.
Le molecole LPS sono costituite da tre costituenti: il lipido A disaccharolipid, l’oligosaccharide del nucleo e l’O-polysaccharide o O-antigen. Il lipid A è un disaccatipio moltiplicato. Core-oligosaccharides sono costituiti da 10-15 zuccheri noti come LPS grezzi o R-LPS. Il nucleo è suddiviso nella regione interna, composta da 2-keto-3-deossiosa-D-manno-octuloniciati (kdo) e uno o più residui di eptosi, e una regione esterna che consiste generalmente di esrossi (glucosio o galactose) ed eptosi, o zuccheri di acetamido5 . L’area del nucleo esterno è più variabile nei suoi componenti e struttura rispetto al nucleo interno. In Salmonella spp., è stata descritta solo una struttura centrale; tuttavia, in Escherichia coli ci sono cinque diverse strutture centrali (designato K-12, R1, R2, R3 e R4)8. E. coli K-12 DH5, che usiamo in questa procedura porta una mutazione che si traduce nella produzione di R-LPS9. Le molecole R-LPS non hanno la moiety O-antigene e hanno un peso molecolare simile alle molecole LOS.
L’aggiunta di O-antigen a R-LPS trasforma questa molecola in LPS lisci, o S-LPS. Gli antigeni O sono costruiti da brevi sottounità di carboidrati 3-4 e consistono in molteplici modalità con diverse lunghezze di catena10. Alcuni batteri che producono LPS, come la Salmonella enterica siriburia Typhimurium (S. Typhimurium), visualizzare una distribuzione trimodale di molecole LPS sulla loro superficie10,11. Gli antigeni O-antigeni a catena molto lunga possono contenere oltre cento sottounità e pesare oltre cento chilodaltoni. Gli antigeni O forniscono proprietà superficiali al batterio che sono necessarie per resistere agli antibiotici, eludere la predazione da batteriofagi e causare malattie.
Specie di Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria e altri generano molecole LOS invece di molecole LPS sulla loro superficie12. Le molecole LOS sono costituite da oligosaccaridi lipidi e core, ma non hanno l’antigene O. Questi tipi di batteri Gram-negativi modificano le loro oligosaccoridi del nucleo con zuccheri aggiuntivi e combinazioni di zuccheri per alterare le proprietà della superficie12. Sia i microbi che loS e i microbi che producono LPS derivano i fosfati sul lipido A e sulle molecole centrali con moieties cationiche7. Queste aggiunte includono fosfoetanolamina, galactosamine e sostituti aminoarabinosi, che funzionano neutralizzando la carica superficiale anionica e proteggendo così contro i peptidi antimicrobici cationici. I batteri Gram-negativi modificano anche la struttura del nucleo dell’oligosaccoride con sostituzioni variabili non stoichiometriche di zuccheri, o molecole extra kdo, e alterano il numero di catene di acili su lipid-A disaccharolipids7.
La capacità di isolare l’IM dall’OM dei batteri Gram-negativi è stata fondamentale per comprendere il ruolo dell’involucro cellulare nella resistenza antimicrobica e nella patogenesi della malattia11,12. Le derivazioni di questo approccio sono state utilizzate per dedurre i meccanismi di assemblaggio, manutenzione e rimodellamento della proteina, del fosfolipido e dei costituenti glicolipidi per l’OM.
Il nostro laboratorio esegue regolarmente analisi lipidomiche batteriche per studiare la regolazione dei lipidi mediati da proteine e la funzione lipidica in una varietà di specie Gram-negative. I volumi utilizzati nel protocollo riflettono l’uso di routine di questa procedura per analizzare fosfolipidi non etichettati con etichettatura non radiografica mediante cromatografia a strati sottili e spettrometria di massa tandem di cromato liquida13,14.
Il protocollo inizia esponendo una sospensione refrigerata di batteri Gram-negativi a una soluzione ad alta osmolare di saccarosio e aggiungendo lysozyme per dissociare l’OM dallo strato peptidoglycan sottostante (Figura 1)12. L’EDTA viene quindi aggiunto per facilitare la penetrazione del liso, poiché il sequestro della cation divalente interrompe le interazioni di bridging elettrostatico laterale tra molecole LOS/LPS adiacenti15. Il protocollo originale da cui è stato adattato il nostro richiedeva la formazione di sferoplasti, una forma di cellule batteriche Gram-negative che consistono in una membrana plasmatica e un citosol, ma manca dello strato peptidoglycan e di un OM. È possibile che gli sferoplasts siano prodotti con il metodo adattato; tuttavia, la tecnica non si basa o intende sulla loro formazione per il successo. Invece, i batteri trattati lysozyme-EDTA vengono rapidamente raccolti dalla centrifugazione e ri-sospesi in una soluzione di saccarosio di minore concentrazione prima della lissi pressurizzata. Le OM che potrebbero essere state rilasciate formando sferoplasti dovrebbero in teoria essere raccoglibili dai supernatanti delle cellule trattate, ma questo approccio non è dettagliato nel presente documento. In definitiva, le cellule trattate sono sottoposte a omogeneizzazione e lisi convenzionale, che migliora l’efficienza e la riproducibilità della procedura di separazione della membrana16.
Dopo la lisi, le membrane totali vengono raccolte per ultracentrifugazione e applicate a un gradiente di densità di discontinuo di saccarosio per frazionare gli IM e gli OM. L’approccio classico utilizza un gradiente più continuo costituito da almeno cinque diverse soluzioni di saccarosio11,12. Il gradiente discontinuo nel nostro protocollo è costituito da tre soluzioni di saccarosio e divide i bistrati in due frazioni distinte17. Le molecole LOS e LPS all’interno delle OM dei batteri Gram-negativi spingono l’involucro a dividersi in una frazione IM a bassa densità marrone superiore e in una frazione OM bianca ad alta densità inferiore(Figura 1 e Figura 2).
Acinetobacter baumannii sono importanti patogeni umani multifarmacoresistenti che producono molecole LOS nel loro OM ed erigono un involucro cellulare che è difficile separare18,19. Recenti lavori suggeriscono che una derivazione del protocollo che presentiamo qui può essere utilizzata per dividere i bistrati di questi organismi20. Pertanto, abbiamo testato il nostro protocollo su A. baumannii 17978. Inizialmente, la procedura era inadeguata. Tuttavia, abbiamo modificato la concentrazione di saccarosio della soluzione a densità media e migliorato notevolmente la separazione (Figura 2). È stato utilizzato un assaggio di disidrogeno NADH e una procedura di estrazione e rilevazione LOS/LPS per confermare la separazione per A. baumannii, di tipo selvaggio S. Typhimurium e due genotipi enterobatterici carenti di O-antigene; vale a dire, galE-mutant S. Typhimurium e un ceppo di laboratorio, E. coli DH5 (Figura 3 e Figura 4).
L’intento di questo lavoro è quello di fornire un approccio semplificato per isolare riproducibilmente le membrane dei batteri Gram-negativi. Il protocollo può essere utilizzato per studiare molti tipi di molecole associate alla membrana per questi microbi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo metodo continuerà ad aiutare i ricercatori a comprendere il ruolo dell’involucro cellulare nella fisiologia batterica e nella patogenesi. Seguendo i passaggi di ultracentrifugazione sequenziali si può ottenere un totale purificato, interno e una frazione OM. Queste membrane possono essere scansionate in isolamento per testare ipotesi relative alla localizzazione e alla funzione delle proteine della membrana, al trasporto e al traffico attraverso il periplasm e alla composizione dei singoli bistrati in varie cond…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da P20GM10344 e R01AI139248 assegnato a D. Dalebroux.
Materials
| 1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene | VWR | 525-0466 | |
| 1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap | VWR | 10416-312 | |
| 2000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth | VWR | 10545-844 | |
| 4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well | BIORAD | 4561095 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer 10 mL | BIORAD | 1610747 | |
| 50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89049-174 | |
| 7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles | VWR | 71000-518 | |
| 70 mL polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter Life Sciences | 355622 | |
| Agar Powder | VWR | A10752 | |
| B10P Benchtop pH Meter with pH Probe | VWR | 89231-664 | |
| Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF – TOC (bench version) | ThermoFisher Scientific | 50136146 | |
| Benzonase Nuclease | MilliporeSigma | 70746-3 | |
| EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker | VWR | 4040-01 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin, Inc. | ||
| Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor | ThermoFisher Scientific | 75006526 | |
| Hydrochloric acid 6.0 N | VWR | BDH7204 | |
| IBI Scientific Orbital Platform Shaker | Fischer Scientific | 15-453-211 | |
| LB Broth Miller | VWR | 214906 | |
| Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade | VWR | VWRV0063 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | M2670 | |
| NADH | Sigma Aldrich | 10107735001 | |
| Optima XPN-80 – IVD | Beckman Coulter Life Sciences | A99839 | |
| Pharmco Products PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS | Fischer Scientific | NC1624582 | |
| Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology | Sigma – Millipore | P4557 | |
| Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit | Thermofisher | 23238 | |
| Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit | Thermofisher | P20495 | |
| Proteacease -50, EDTA free | G Biosciences | 786-334 | |
| Proteinase K, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium hydroxide ≥99.99% | VWR | AA45780-22 | |
| Sorval RC 6 Plus Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 36-101-0816 | |
| Sucrose | MilliporeSigma | SX1075-3 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker | VWR | JT4109-6 | |
| Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 339160 | |
| Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm | Beckman Coulter Life Sciences | 344059 | |
| Vortex-Genie 2 | VWR | 102091-234 |
Riferimenti
- Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414 (2010).
- Egan, A. J., Vollmer, W. The physiology of bacterial cell division. Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).
- Pazos, M., Peters, K., Vollmer, W. Robust peptidoglycan growth by dynamic and variable multi-protein complexes. Current Opinion in Microbiology. 36, 55-61 (2017).
- Raetz, C. R. Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 42, 614-659 (1978).
- Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).
- Needham, B. D., Trent, M. S. Fortifying the barrier: the impact of lipid A remodelling on bacterial pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 11, 467-481 (2013).
- Simpson, B. W., Trent, M. S. Pushing the envelope: LPS modifications and their consequences. Nature Reviews Microbiology. 17, 403-416 (2019).
- Ebbensgaard, A., Mordhorst, H., Aarestrup, F. M., Hansen, E. B. The Role of Outer Membrane Proteins and Lipopolysaccharides for the Sensitivity of Escherichia coli to Antimicrobial Peptides. Frontiers in Microbiology. 9, 2153 (2018).
- Liu, D., Reeves, P. R. Escherichia coli K12 regains its O antigen. Microbiology. 140 (1), 49-57 (1994).
- Kalynych, S., Morona, R., Cygler, M. Progress in understanding the assembly process of bacterial O-antigen. FEMS Clinical Microbiology Reviews. 38, 1048-1065 (2014).
- Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane. Journal of Biological Chemistry. 247, 3962-3972 (1972).
- Osborn, M. J., Munson, R. Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of Gram-negative bacteria. Methods in Enzymology. 31, 642-653 (1974).
- Cian, M. B., Giordano, N. P., Masilamani, R., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Salmonella enterica serovar Typhimurium use PbgA/YejM to regulate lipopolysaccharide assembly during bacteremia. Infection and Immunity. , (2019).
- Masilamani, R., Cian, M. B., Dalebroux, Z. D. Salmonella Tol-Pal Reduces Outer Membrane Glycerophospholipid Levels for Envelope Homeostasis and Survival during Bacteremia. Infection and Immunity. 86, (2018).
- Nikaido, H. Outer Membrane of Salmonella-Typhimurium Transmembrane Diffusion of Some Hydrophobic Substances. Biochimica Et Biophysica Acta. 433, 118-132 (1976).
- Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).
- Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).
- Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp. Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).
- Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability. Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).
- Kamischke, C., et al. The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane. Elife. 8, (2019).
