Evaluering af T Follikulære Hjælpeceller og Germinal Center Response Under Influenza A Virus Infektion i Mus
Summary
Dette papir beskriver protokoller for evaluering af Tfh og GC B respons i mus model af influenzavirus infektion.
Abstract
T Follicular Helper (Tfh) celler er en uafhængig CD4+ T celle delmængde specialiseret i at yde hjælp til germinal center (GC) udvikling og produktion af høj-affinitet antistoffer. I influenzavirusinfektion induceres robuste Tfh- og GC B-celleresponser for at lette effektiv virusudryddelse, hvilket giver en kvalificeret musemodel til Tfh-associeret undersøgelse. I dette papir beskrev vi protokoller til påvisning af grundlæggende Tfh-associeret immunrespons under influenzavirusinfektion hos mus. Disse protokoller omfatter: intranasal podning af influenzavirus; cytometribejdning og analyse af polyklonale og antigenspecifikke Tfh-celler, GC B-celler og plasmaceller påvisning af immunfluorescens i GC’er enzymrelateret immunosorbentanalyse (ELISA) af influenzavirusspecifikt antistof i serum. Disse assays dybest set kvantificere differentiering og funktion af Tfh celler i influenzavirus infektion, hvilket giver hjælp til undersøgelser i belyse differentiering mekanisme og manipulation strategi.
Introduction
I det seneste årti har adskillige undersøgelser været fokuseret på den nyligt identificerede CD4+ T celle delmængde, Tfh celle delmængde, for sine væsentlige roller i germinal center (GC) B udvikling. B celle lymfom 6 (Bcl6), som hovedsagelig betragtes som et gen repressor, er afstamning-definerende faktor Tfh celler for beviser for, at ektopisk udtryk for Bcl6 er tilstrækkelig til at drive Tfh differentiering, mens mangel på Bcl6 resulterer i forsvundet Tfh differentiering1,2,3. I modsætning til andre CD4+ T hjælper delmængder udfører deres effector funktion ved migration til de steder af inflammation, Tfh celler giver B-celle hjælp primært i B celle follikulær zone milt og lymfeknude. Co-stimulerende molekyler ICOS og CD40L, spiller en væsentlig rolle i samspillet mellem Tfh og GC B celler. Under Tfh differentiering, ICOS sender nødvendige signaler fra cognate B-celler og fungerer også som en receptor modtager migration signaler fra tilskuer B-celler til B cellezone lokalisering4,5. CD40L er en mediator af signaler fra Tfh celler til B-celler spredning og overlevelse6. En anden faktor, der spiller den lignende rolle som CD40L, er cytokinEN IL21, som hovedsageligt udskilles af Tfh-celler. IL21 regulerer direkte GC B-cellers udvikling og produktion af antistoffer med høj affinitet, men dets rolle i Tfh-differentiering er stadig kontroversiel7,8. PD-1 og CXCR5, som nu hyppigst anvendes til at identificere Tfh-celler i flowcytometrianalyse, spiller også en væsentlig rolle i differentieringen og funktionen af denne delmængde. CXCR5 er receptoren af B-celle follikulært kemokin og formidler lokaliseringen af Tfh-celler i B-cellesække9. PD-1 er nu identificeret til ikke kun at have follikulær vejledning funktion, men også sende kritiske signaler i processen med GC B celler affinitet modning10. Baseret på disse fund kunne evaluering af ekspressionen af disse molekyler dybest set afspejle modningen og funktionen af Tfh-celler.
GC er en induceret forbigående mikroanatomisk struktur i sekundære lymfoide organer og meget afhængig af Tfh-celler, hvilket er en perfekt udlæsning til at evaluere Tfh-respons. I GC, efter at have modtaget signaler medieret af cytokiner og co-stimulerende molekyler, er B-celler underlagt klasseskift og somatisk hypermutation for at generere antistoffer med høj affinitet11. Differential antistof klasseskift forekommer i differentialcytokin niche, hvor IL4 og IL21 fremkaldeR IgG1 klasseskift, mens IFNγ inducerer IgG2 klasseskift12. Plasmaceller er producenter af udskillede antistoffer og er uhelbredeligt differentierede celler. Ligesom Tfh celler, udvikling af B-celler i GC er forbundet med dynamisk udtryk for mange væsentlige molekyler. Baseret på den aktuelle undersøgelse kan GC B-celler identificeres som B220+PNA+Fas+ eller B220+GL7+Fas+ celler og plasmaceller sammenlignet med deres prækursorer, nedregulerer ekspressionen af B220 og opregulerer CD138-udtryk13. Desuden kan begge disse egenskaber påvises i flowcytometry- og immunfluorescensanalyse, hvilket er en passende evaluering af GC-respons.
Robust cellulære og humoristiske reaktioner er induceret i influenzavirus infektion, med Tfh og Th1 celler dominerer CD4+ T cellerespons14, hvilket gør det til en perfekt model for Tfh celler differentiering undersøgelse. Influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1(PR8), som er en almindeligt anvendt musetilpasset stamme, anvendes ofte i denne undersøgelse14,15,16. Her beskriver vi nogle grundlæggende protokoller for Tfh-undersøgelsesrelevant analyse i influenzavirusinfektion: 1) intranasal podning af PR8-virus; 2) antigenspecifikke Tfh-celler, GC B- og plasmaceller og IL21-detektion med flowcytometri 3) histologisk visualisering af GC; 4) påvisning af antigenspecifik antistoftitler i serum med ELISA. Disse protokoller giver de nødvendige teknikker til nye forskere i Tfh-associeret undersøgelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund af specialiserede roller i at give B-celle hjælp til at generere høj-affinitet antistoffer, Tfh celler er blevet grundigt undersøgt i mekanismerne for differentiering og manipulation til at give nye strategier for vaccine design. Influenzavirusinfektion fremkalder kraftige Tfh- og GC B-celler, hvilket er en passende model for dette forskningsområde. I dette papir beskrev vi protokoller for influenzavirusinfektion ved intranasal inokulering, evaluering af Tfh-associeret respons ved flowcytometry, immunfluore…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker stabe flow cytometry facilitet, ABSL2 facilitet og SPF dyrefacilitet institut Pasteur i Shanghai for deres tekniske hjælp og rådgivning. Dette arbejde blev støttet af følgende tilskud: Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences (XDB29030103), National Key R&D Program of China (2016YFA0502202), National Natural Science Foundation of China (31570886).
Materials
| Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Anti-CD16/32 mouse | Thermo Fisher Scientific | 14-0161-86 | |
| APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer | NIH | ||
| Bcl-6 PE | Biolegend | 358504 | clone:7D1 |
| Biotin-CXCR5 | Thermo Fisher Scientific | 13-7185-82 | clone: SPRCL5 |
| CD4 Percp-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-0041-82 | clone:GK1.5 |
| CD44 eVolve 605 | Thermo Fisher Scientifi | 83-0441-42 | clone:IM7 |
| CD44 FITC | Thermo Fisher Scientifi | 11-0441-82 | clone:IM7 |
| CD62L FITC | BD Pharmingen | 553150 | clone:MEL-14 |
| ICOS BV421 | Biolegend | 564070 | clone:7E.17G9 |
| PD1 PE/Cy7 | Biolegend | 135216 | clone:29F.1A12 |
| Streptavidin BV421 | BD Pharmingen | 563259 | |
| Streptavidin PE | BD Pharmingen | 554081 | |
| Intracelluar staining of IL21 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| anti-human IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-605-098 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| human FCc IL-21 receptor | R&D System | ||
| ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit | Thermo Fisher Scientific | L34966 | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Saponin | MP | 102855 | |
| GC B and plasma cells staining | |||
| B220 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0452-81 | clone:RA3-6B2 |
| CD138 PE | BD Pharmingen | 561070 | clone:281-2 |
| CD95 (FAS) PE/Cy7 | BD Pharmingen | 557653 | clone:Jo2 |
| IgD eFluor 450 | Thermo Fisher Scientific | 48-5993-82 | clone:11-26c |
| PNA FITC | Sigma | L7381 | |
| Assay of HA-specific antibody titer with ELISA | |||
| PR8-HA | Sino Biological | 11684-V08H | |
| BSA | SSBC | ||
| Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Pharmingen | 555214 | |
| Histology | |||
| Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG | Life Technology | A21434 | |
| anti-mouse IgD | Biolegend | 405702 | |
| biotinylated PNA | Vector laboratories | B-1075 | |
| dilute Alexa Fluor 488-streptavidin | Life Technology | S11223 | |
| normal goat serum | SouthernBiotech | 0060-01 | |
| Pro-long gold antifade reagent | Thermo Fisher Scientific | P3630 | |
| STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kit | Vector laboratories | SP-2002 |
Riferimenti
- Johnston, R. J., et al. Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
- Yu, D., et al. The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
- Pedros, C., et al. A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1. Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).
- Xu, H., et al. Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility. Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).
- Lee, S. K., et al. B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).
- Zotos, D., et al. IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism. The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).
- Vogelzang, A., et al. A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells. Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).
- Ansel, K. M., et al. A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles. Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).
- Shi, J., et al. PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function. Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).
- Methot, S. P., Di Noia, J. M. Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination. Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).
- Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).
- Calame, K. L. Plasma cells: finding new light at the end of B cell development. Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).
- Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection. The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).
- Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability. Nature Communications. 5, 3495 (2014).
- He, L., et al. Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).
- León, B., et al. Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells. Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).
- Wang, H., et al. The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells. Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).
- Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
- Miyauchi, K., et al. Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells. Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).
- Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Kitano, M., et al. Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity. Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).
- Yusuf, I., et al. Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150). The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).
- Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs. Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).
