Avbildning DPP-utgåva från en Drosophila Wing-skiva
Summary
Tidpunkten för exponeringen för ligander kan påverka deras utvecklingsmässiga konsekvenser. Här visar vi hur man bild release av en Drosophila Bone morfogenetiska protein (bmp) kallas DPP från celler i Wing Disc.
Abstract
Den omvandla tillväxtfaktor-beta (TGF-β) superfamiljen är viktigt för tidig embryonal mönster och utveckling av vuxna strukturer i flercelliga organismer. Den TGF-β superfamiljen omfattar TGF-β, ben morfogenetiska protein (BMPs), Activins, tillväxt och differentiering faktorer, och Nodals. Det har länge varit känt att mängden ligand utsätts för celler är viktigt för dess effekter. Det ansågs att långväga koncentrations gradienter inrätta embryonala mönster. Men nyligen har det blivit klart att tidpunkten för exponeringen för dessa ligander är också viktigt för deras nedströms transkriptionella konsekvenser. En TGF-β-superfamilj ligand kan inte ha en utvecklingsmässig konsekvens förrän den frigörs från den cell där den producerades. Tills nyligen var det svårt att avgöra när dessa ligander släpptes från celler. Här visar vi hur man mäter frisläppandet av en Drosophila BMP kallas Decapentaplegic (DPP) från cellerna i Wing primordium eller Wing Disc. Denna metod kan ändras för andra system eller signalering ligands.
Introduction
Ben morfogenetiska proteiner (BMPs) är viktiga för tidig embryogenes och mönstringen av vuxna strukturer. BMPs produceras och utsöndras för att påverka transkription av målgener som behövs för tillväxt och celldifferentiering i att reagera celler. Decapentaplegic (DPP) är en Drosophila homolog av BMP4 som är viktig för utvecklingen av embryonala och vuxna strukturer som Wing1,2,3,4. Flera grupper har fokuserat på rollen som DPP i mönstringen Adult fly Wings eftersom 1) vingarna består av två transparenta epitel ark med en konsekvent Ådringen mönster som lätt kan bedömas; 2) vingen skivorna är också rimligt platt, kan odlas utanför larven, och är enkla att bild och kvantifiera skillnader i mönster; och 3) Ving mönstret utveckling är känsligt för DPP så att små störningar i vägen kommer att påverka Wing Ådringen mönster.
DPP produceras i celler som finns i den främre/bakre gränsen av Wing Disc5,6,7,8. DPP binder till ett komplex av typ 1-och typ 2-serin/treoninkinasreceptorer9,10. Vid DPP-bindning, typ 2-receptorn fosforylater typ 1-receptorn som sedan fosforylerar mödrar mot DPP (MAD), en SMAD 1/5/8 homolog. Fosforylerade SMAD rekryterar en extra Co-SMAD (Medea), som gör det möjligt att komma in i kärnan där den reglerar målgener, vilket leder till nedströms effekter såsom proliferation eller differentiering4,11.
Nyligen har Bates Lab visat att felaktig frisättning av DPP inom Wing-skivan kan leda till en minskning av Mad fosforylering, minskning av mål genuttryck, och Ving mönster defekter12,13. Flera Jon kanaliserar får effektutveckling av drosophilaen påskyndar och tillhörande strukturerar14,15. Dessa jonkanaler kan också vara involverade i DPP-utgåvan. Vid bestämning av mekanismen för morphogen release, det är viktigt att det finns en metod för att visualisera release händelser.
DRS. Aurelio Teleman och Stephen Cohen skapade en DPP-GFP fusion protein som kan rädda förlust av DPP, vilket innebär att det är biologiskt aktiv och släpps på ett biologiskt relevant sätt16. Här beskriver vi hur vi visualisera DPP release händelser med hjälp av denna DPP-GFP. Detta fusionsprotein är särskilt användbart eftersom GFP är pH-känsligt så att när det är i sura blåsor, är fluorescensen släckt17. Därför, när ett protein som är märkta med GFP frigörs från en vesikel i den mer neutrala extracellulära miljön, ökar GFP fluorescens intensitet17. Vi utnyttjade pH-känsligheten hos GFP för att avgöra om DPP-GFP är bosatt i sura blåsor. Vi avbildade Wing skivor uttrycker DPP-GFP före och efter tillsats av ammoniumklorid, som neutraliserar intracellulära fack blåsor18. Vi fann en signifikant ökning av fluorescensen av Auktor efter tillsats av ammoniumklorid, vilket tyder på att intracellulära DPP-GFP är släckt innan tillsats av ammoniumklorid18. Vi drar slutsatsen att intracellulära DPP-GFP bosatt i sura membran-bundna avdelningar, såsom blåsor, och är OSLÄCKT vid tillsats av ammoniumklorid att neutralisera pH i intracellulära fack18. Detta gör Live Imaging av DPP-GFP en användbar teknik för att visualisera dynamiken i DPP i Drosophila Wing skivan som den släpps från sura fack i den extracellulära miljön.
Här beskriver vi den metod vi använder för att visualisera DPP release händelser med hjälp av DPP-GFP. DPP-GFP kan uttryckas i sitt ursprungliga mönster i Drosophila Wing skivor med hjälp av UAS-GAL4 system19. Detta är den metod som användes för att fastställa att IRK kanaler Impact DPP release18. Vi validerade metoden genom Live-Imaging z-stackar. Vi ser inte DPP-GFP Auktor rör sig inom det plan av fokus i tidsserier om vi förvärvade i ett plan av fokus. Vi ser inte heller förflyttning av DPP-GFP Auktor om vi avbildas i en z-stack. Vi drar slutsatsen att DPP-GFP Auktor sett med denna metod är release händelser snarare än förflyttning av vesikler intracellulärt. Denna metod för Live-avbildning av DPP-GFP kan potentiellt användas för att testa andra förmodade modifierare av DPP release för deras inverkan på DPP dynamik eller kan ändras för att titta på dynamiken i andra ligander
Protocol
Representative Results
Discussion
BMPs som DPP göra sin betydande inverkan när de binder ett komplex av membranbundna receptorer för att orsaka en kaskad av Intracellulär signalering i angränsande eller tydligen avlägsna celler. Dr Thomas Kornberg ‘ s Lab har visat att celler som producerar DPP signalkontakt celler som tar emot signalen med hjälp av aktin baserade tunna filapodia-liknande strukturer som kallas cytonemes15,24,25. Dessa data tyder på att u…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Dr. Sarala Pradhan för att ha arbetat med en tidigare version av detta protokoll. Vi skulle vilja tacka NSF-IOS 1354282 för finansiering medan vi utvecklat detta protokoll. Vi vill tacka NIH-NIDCR RO1DE025311 för finansiering av vårt labb för närvarande.
Materials
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
Riferimenti
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo. Cell. 71 (3), 451-461 (1992).
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo. Development. 114 (3), 583-597 (1992).
- Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo. Development. 117 (2), 807-822 (1993).
- Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila. Genetica. 139 (1), 241-254 (1995).
- Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary. Development. 113 (1), 27-33 (1991).
- Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. An extensive 3′ cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila. Development. 111 (3), 657-666 (1991).
- de Celis, J. F. Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing. Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Letsou, A., et al. Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family. Cell. 80 (6), 899-908 (1995).
- Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic. Cell. 78 (2), 225-237 (1994).
- Raftery, L. A., Sutherland, D. J. TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads. Biologia dello sviluppo. 210 (2), 251-268 (1999).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Dahal, G. R., et al. An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning. Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).
- George, L. F., et al. Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster. G3. 9 (4), 999-1008 (2019).
- Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Glutamate signaling at cytoneme synapses. Science. 363 (6430), 948-955 (2019).
- Teleman, A. A., Cohen, S. M. Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc. Cell. 103 (6), 971-980 (2000).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Hazegh, K. E., Reis, T. A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (117), e54744 (2016).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic. Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332 (6027), 354-358 (2011).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Cytonemes as specialized signaling filopodia. Development. 141 (4), 729-736 (2014).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Communicating by touch–neurons are not alone. Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).
