التصوير التقدمي الإفراج عن القرص الجناح دروفيا
Summary
وقد يؤثر توقيت التعرض للمضايق علي اثارها الانمائيه. هنا نعرض كيفيه الإفراج عن صوره من البروتين الوراثي العظام دروفوليا (BMP) تسمي النيابة التقدمية من خلايا القرص الجناح.
Abstract
عامل النمو تحويل-بيتا (tgf-β) [سوبرفميلي] ضروري لزخرفه الجنينية في وقت مبكر وتطوير هياكل الكبار في الكائنات متعددة الخلايا. وتشمل العائلة الفائقة TGF-β TGF-β ، بروتين العظام الموريفوجيني (BMPs) ، Activins ، والنمو وعوامل التمايز ، وعقيديه. ومن المعروف منذ فتره طويلة ان كميه الاربطه المعرضة للخلايا مهمة لأثاره. وكان يعتقد ان تدرجات التركيز طويلة المدى اعداد نمط الجنينية. ومع ذلك ، أصبح من الواضح في الاونه الاخيره ان توقيت التعرض لهذه اليغاندس مهم أيضا لعواقبها النقل النهائي. ولا يمكن ان يكون لهذه الاسره الفائقة الأثر التنموي حتى يتم إطلاقها من الخلية التي أنتجت فيها. وحتى وقت قريب ، كان من الصعب تحديد متى تم الإفراج عن هؤلاء المدافعين من الخلايا. هنا نعرض كيفيه قياس الإفراج عن دروفيسيلا BMP تسمي ديبننتابلاييك (النيابة التقدمية) من خلايا الجناح القرص أو الجناح. يمكن تعديل هذه الطريقة للانظمه الأخرى أو للاشاره إلى الإشارات الليفية.
Introduction
البروتينات الدهنية العظمية (BMPs) ضرورية لتولد الاجنه في وقت مبكر وزخرفه هياكل البالغين. يتم إنتاج BMPs ويفرز للتاثير علي النسخ من الجينات المستهدفة اللازمة للنمو وتمايز الخلايا في الخلايا المستجيبة. قطع الراس (النيابة التقدمية) هي دروفيميلا هوكولوغ من BMP4 التي هي مهمة لتطوير البني الجنينية والبالغين مثل الجناح1،2،3،4. وقد ركزت عده مجموعات علي دور النيابة العامة في اجنحه يطير الكبار زخرفه لان 1) وتتالف الاجنحه من اثنين من أوراق النعت شفافة مع نمط التعرق متسقة التي يمكن تقييمها بسهوله; 2) أقراص الجناح هي أيضا مسطحه بشكل معقول ، يمكن ان يكون مثقفا خارج اليرقة ، وبسيطه للصورة والاختلافات الكمية في نمط ؛ و 3) الجناح نمط التنمية حساسة لل النيابة العامة من هذا القبيل ان الاضطرابات الصغيرة في المسار سوف تؤثر علي نمط تعرق الجناح.
يتم إنتاج النيابة العامة في الخلايا الموجودة في الحدود الاماميه/الخلفية للقرص الجناح5،6،7،8. النيابة التقدمية يربط إلى مجمع من نوع 1 ونوع 2 سيرين/threonine كيناز مستقبلات9,10. علي [شف] ربط, النوع 2 مستقبل فوسفولات النوع 1 مستقبل اي بعد ذلك [فوسفورلتس] أمهات ضد [شف] ([ماد]), [سماد] 1/5/8 [هوولوغ]. [فوسفورلتد] [سماد] يجند اضافيه [ك-سماد] ([مديه]), اي يمكن هو دخلت إلى النواة حيث هو ينظم مورثات مستهدفه, يقود إلى مصب تاثيرات مثل انتشار أو تمييز4,11.
في الاونه الاخيره ، وقد أظهرت مختبر بيتس ان الإفراج غير لائق من النيابة العامة داخل القرص الجناح يمكن ان يؤدي إلى انخفاض في الفوسفات جنون ، والحد من التعبير الجيني المستهدف ، والجناح زخرفه العيوب12،13. العديد من القناات الايونيه تؤثر علي تطوير جناح دروفيبيلا والهياكل المرتبطة به14،15. ويمكن ان تشارك هذه القناات الايونيه أيضا في الإفراج عن النيابة العامة. في تحديد اليه الإفراج عن مورفجين ، من المهم ان هناك طريقه لتصور احداث الإصدار.
وقد إنشا السيد اوريليو تيلمان وستيفن كوهين بروتينا منصهرا للتقدمي-GFP قادرا علي إنقاذ فقدان النيابة العامة ، وهذا يعني انها نشطه بيولوجيا ويتم إطلاقها بطريقه ذات صله بيولوجيا16. هنا ، ونحن وصف كيف يمكننا تصور الاحداث الإفراج عن النيابة التقدمية باستخدام هذا الحزب التقدمي الاشتراكي-GFP. هذا البروتين الانصهار مفيد بشكل خاص لان GFP حساسة لدرجه الحموضة حيث انه عندما يكون في الحويصلات الحمضية ، ويروي فلوري17. ولذلك ، عندما يتم الإفراج عن بروتين الموسومة مع GFP من حويصلة في بيئة أكثر حياديه خارج الخلية ، وزيادة كثافة الفلورية GFP17. أخذنا الاستفادة من حساسية الأس الهيدروجيني من GFP لتحديد ما إذا كان النائب العام التقدمي-GFP يقيم في الحويصلات الحمضية. نحن تصوير أقراص الجناح التعبير عن الحزب التقدمي الاشتراكي-gfp قبل وبعد أضافه كلوريد الأمونيوم ، والتي تحييد المقصورات داخل الخلايا الحويصلات18. وجدنا زيادة كبيره في مضان من الثقوب بعد أضافه كلوريد الأمونيوم ، مما يوحي بان التقدمي-GFP داخل الخلايا هو مروي قبل أضافه كلوريد الأمونيوم18. ونحن نستنتج ان النيابة العامة داخل الخلايا-GFP يتواجد في مقصورات الغشاء الحمضية ، مثل الحويصلات ، وغير مروي علي أضافه كلوريد الأمونيوم لتحييد الأس الهيدروجيني من المقصورات داخل الخلايا18. وهذا يجعل التصوير الحي للحزب التقدمي الاشتراكي-GFP أسلوبا مفيدا لتصور ديناميات النيابة العامة في قرص جناح دروفيسيلا حيث يتم إطلاقها من المقصورات الحمضية في البيئة خارج الخلية.
هنا ، ونحن وصف الطريقة التي نستخدمها لتصور الاحداث الإفراج عن النيابة التقدمية باستخدام الحزب التقدمي الاشتراكي-GFP. ويمكن التعبير عن الحزب التقدمي الاشتراكي في نمطه الأصلي في أقراص جناح دروفيا باستخدام نظام GAL419. هذا هو الأسلوب الذي تم استخدامه لتحديد ان قنوات Irk تؤثر علي الإفراج عن النيابة العامة18. قمنا بالتحقق من صحة الأسلوب عن طريق التصوير الحي لأكوام z. نحن لا نري الحزب التقدمي الاشتراكي-GFP ثقب في التحرك داخل الطائرة من التركيز في سلسله زمنيه إذا حصلنا علي مستوي واحد من التركيز. كما اننا لا نري حركه النيابة العامة-GFP ثقب إذا كنا الذين في كومه z. ونستنتج ان ثقب النيابة-GFP التي شوهدت باستخدام هذه الطريقة هي احداث الإفراج بدلا من حركه الحويصلات اينتراسيلولارلي. ويمكن استخدام هذه الطريقة من التصوير الحي للحزب التقدمي الاشتراكي-gfp لاختبار المعدلات المفترضة الأخرى من الإفراج عن النيابة التقدمية لتاثيرها علي ديناميات النيابة التقدمية أو يمكن تعديلها للنظر في ديناميات يغاندس الأخرى
Protocol
Representative Results
Discussion
BMPs مثل النيابة العامة جعل تاثيرها الكبير عندما ربط معقده من المستقبلات غشاء ملزمه للتسبب في سلسله من الإشارات داخل الخلايا في المجاورة أو علي ما يبدو النائية. وقد أظهرت مختبر الدكتور توماس كورنبرغ ان الخلايا التي تنتج الخلايا الاتصال اشاره النيابة التقدمية التي تتلقي الاشاره باستخدام ال…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود ان نشكر الدكتورة سارالا برادان علي العمل علي إصدار سابق لهذا البروتوكول. ونود ان نشكر NSF-دائره الرقابة الخارجية 1354282 للحصول علي التمويل في حين وضعنا هذا البروتوكول. نود ان نشكر المعاهد القومية للصحة-NIDCR RO1DE025311 لتمويل مختبرنا حاليا.
Materials
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
Riferimenti
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo. Cell. 71 (3), 451-461 (1992).
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo. Development. 114 (3), 583-597 (1992).
- Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo. Development. 117 (2), 807-822 (1993).
- Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila. Genetica. 139 (1), 241-254 (1995).
- Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary. Development. 113 (1), 27-33 (1991).
- Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. An extensive 3′ cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila. Development. 111 (3), 657-666 (1991).
- de Celis, J. F. Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing. Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Letsou, A., et al. Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family. Cell. 80 (6), 899-908 (1995).
- Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic. Cell. 78 (2), 225-237 (1994).
- Raftery, L. A., Sutherland, D. J. TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads. Biologia dello sviluppo. 210 (2), 251-268 (1999).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Dahal, G. R., et al. An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning. Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).
- George, L. F., et al. Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster. G3. 9 (4), 999-1008 (2019).
- Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Glutamate signaling at cytoneme synapses. Science. 363 (6430), 948-955 (2019).
- Teleman, A. A., Cohen, S. M. Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc. Cell. 103 (6), 971-980 (2000).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Hazegh, K. E., Reis, T. A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (117), e54744 (2016).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic. Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332 (6027), 354-358 (2011).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Cytonemes as specialized signaling filopodia. Development. 141 (4), 729-736 (2014).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Communicating by touch–neurons are not alone. Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).
