成像 Dpp 释放从果蝇翼光盘
Summary
接触配体的时机可能会影响其发育后果。在这里，我们展示如何图像释放的果蝇骨形态遗传蛋白（BMP），称为Dpp从翅膀盘的细胞。
Abstract
转化的生长因子-β（TGF-β）超级家族对于多细胞生物中早期胚胎模式的形成和成人结构的发展至关重要。TGF-+超级家族包括TGF-α、骨形态遗传蛋白（BMPs）、活动因子、生长和分化因子以及诺达尔。人们早就知道，暴露于细胞的配体量对它的影响很重要。据认为，远距离浓度梯度建立了胚胎模式。然而，最近很明显，接触这些配体的时机对于它们的下游转录结果也很重要。TGF-+超级家族配体在从产生它的细胞中释放出来之前不能有发育后果。直到最近，还很难确定这些配体何时从细胞中释放出来。在这里，我们展示如何测量一种称为十苯酚（Dpp）的果蝇BMP从翼子板或翼盘的细胞中释放。此方法可以修改为其他系统或信令配体。
Introduction
骨形态遗传蛋白（BMPs）对于早期胚胎生成和成人结构模式形成至关重要。BBM 被生成和分泌，以影响响应细胞中生长和细胞分化所需的靶基因的转录。十进制（Dpp）是BMP4的果蝇同源体，对胚胎和成人结构的发展，如翼1，2，3，4是重要的。几个团体关注民进党在图案化成人飞翼的角色，因为1）翅膀由两张透明的上皮片组成，其图案一致，易于评估;2）翼盘也相当平坦，可在幼虫外培养，且易于成像和量化图案差异;3）翼型发展对民进党很敏感，因此路径上的小扰动会影响翼形图案。
Dpp是在位于翼盘5、6、7、8的前/后边界的细胞中产生的。Dpp绑定到1型和2型丝氨酸/色氨酸激酶受体9，10的复合体。在Dpp结合时，2型受体磷化1型受体，然后磷化母亲对Dpp（Mad），一个Smad 1/5/8同源。磷酸化SMAD招募了额外的共同Smad（美地），它使它进入细胞核，在那里它调节目标基因，导致下游效应，如增殖或分化4，11。
最近，贝茨实验室显示，在翼盘内不当释放Dpp会导致狂磷化减少，目标基因表达减少，以及机翼图案缺陷12、13。几个孔通道影响果蝇翼和相关结构的发展14，15。这些子通道也可能参与民进党的释放。在确定变形原释放的机制时，必须采用一种方法来可视化释放事件。
奥雷利奥·泰尔曼博士和斯蒂芬·科恩博士发明了一种Dpp-GFP融合蛋白，能够挽救Dpp的损失，这意味着它在生物学上是活跃的，并且以与生物学相关的方式释放16。在这里，我们描述我们如何可视化 Dpp 发布事件使用此 Dpp-GFP。这种融合蛋白是特别有用的，因为GFP是pH敏感，以至于当它是在酸性囊泡，荧光是淬火17。因此，当标有GFP的蛋白质从囊泡释放到更中性的细胞外环境中时，GFP荧光强度增加17。我们利用GFP的pH敏感性来确定Dpp-GFP是否存在于酸性囊泡中。我们图像翼盘表达Dpp-GFP之前和之后添加氯化铵，其中中和细胞内腔囊泡18。我们发现，在添加氯化铵后，普克塔的荧光显著增加，这表明在添加氯化铵18之前，细胞内Dpp-GFP是淬火的。我们得出结论，细胞内Dpp-GFP驻留在酸性膜结合的隔间，如囊泡，并在添加氯化铵后解脱，以中和细胞内腔内18的pH值。这使得Dpp-GFP的实时成像成为一种有用的技术，可以可视化Dpp在果蝇翼盘中的动态，因为它从酸性隔间释放到细胞外环境中。
在这里，我们描述了我们使用 Dpp-GFP 可视化 Dpp 发布事件的方法。Dpp-GFP可以用UAS-GAL4系统19在果蝇翼盘的本土模式来表达。这是用来确定Irk频道影响Dpp版本18的方法。我们通过实时映像 z 堆栈验证了该方法。如果我们在一个焦点平面上获得，我们看不到Dpp-GFP puncta在时间序列的焦点平面内移动。如果我们在 z 堆栈中成像，我们也看不到 Dpp-GFP 的庞塔移动。我们得出结论，使用这种方法看到的Dpp-GFP puncta是释放事件，而不是细胞内囊泡的运动。这种民进党-GFP的实时成像方法，有可能用于测试民进党释放的其他假定修饰符对民进党动态的影响，也可以修改，以观察其他配体的动态
Protocol
Representative Results
Discussion
公诉人等BSP在结合复杂的膜结合受体，在邻近或显然是遥远的细胞中引起细胞内信号的级联时，会产生显著的影响。ThomasKornberg博士的实验室已经表明，产生Dpp信号接触细胞的细胞使用基于活性素的瘦丝波迪亚状结构（称为cytonemes15、24、25）接收信号。这些数据表明，这种背景下的发育细胞-细胞通信可能类似于神经元突<sup clas…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢萨拉拉·普拉丹博士为这一议定书的早期版本开展工作。我们要感谢 NSF-IOS 1354282 在开发此协议时提供的资金。我们要感谢NIH-NIDCR RO1DE025311目前为实验室提供资金。
Materials
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
Riferimenti
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