Billedbehandling DPP-udgivelse fra en Drosophila -vinge skive
Summary
Tidspunktet for eksponering for ligander kan påvirke deres udviklingsmæssige konsekvenser. Her viser vi hvordan man billede frigivelse af en Drosophila knogle morfogenetisk protein (BMP) kaldet DPP fra celler i vinge skiven.
Abstract
Den transformerende vækstfaktor-Beta (TGF-β) super familie er afgørende for tidlig embryonale mønster og udvikling af voksne strukturer i flercellede organismer. Den TGF-β superfamilien omfatter TGF-β, knogle morfogenetisk protein (bmps), activins, vækst og differentiering faktorer, og nodals. Det har længe været kendt, at mængden af ligand udsat for celler er vigtig for dens virkninger. Det blev antaget, at langtrækkende koncentrations gradienter oprettet embryonale mønster. Men for nylig er det blevet klart, at tidspunktet for udsættelse for disse ligander er også vigtigt for deres downstream transkriptionelle konsekvenser. En TGF-β super familie ligand kan ikke have en udviklingsmæssige konsekvens, før den frigives fra den celle, hvor den blev produceret. Indtil for nylig var det svært at afgøre, hvornår disse ligander blev frigivet fra celler. Her viser vi hvordan man måler frigivelsen af en Drosophila BMP kaldet Decapentaplegic (DPP) fra cellerne i Wing primordium eller Wing disc. Denne metode kan ændres for andre systemer eller signalering ligands.
Introduction
Knogle morfogenetiske proteiner (BMPs) er afgørende for tidlig embryogenese og mønster af voksne strukturer. BMPs produceres og udskilles for at påvirke transkriptionen af målgener, der er nødvendige for vækst og Celledifferentiering i responderende celler. Decapentaplegic (DPP) er en Drosophila ligner af BMP4, der er vigtig for udviklingen af embryonale og voksne strukturer som vinge1,2,3,4. Flere grupper har fokuseret på rollen som DPP i mønstret voksen flue vinger, fordi 1) vingerne består af to gennemsigtige epitel ark med et konsistent åretegningen mønster, der let kan vurderes; 2) vinge skiver er også rimeligt fladt, kan dyrkes uden for Larven, og er enkle at billede og kvantificere forskelle i mønster; og 3) vinge mønsteret udvikling er følsom over for DPP sådan, at små forstyrrelser i vejen vil påvirke vinge åretegningen mønster.
DPP produceres i celler beliggende i den forreste/bageste grænse af vinge skiven5,6,7,8. DPP binder sig til et kompleks af type 1 og type 2 Serin/threonine kinase receptorer9,10. Ved DPP binding, type 2 receptor fosforylerer type 1 receptor, som derefter fosforylerer mødre mod DPP (mad), en SMAD 1/5/8 homolog. Fosforylerede SMAD rekrutterede en yderligere Co-SMAD (Medea), som gør det muligt at komme ind i kernen, hvor det regulerer målgener, hvilket fører til downstream-effekter såsom spredning eller differentiering4,11.
For nylig, Bates Lab har vist, at forkert frigivelse af DPP i vinge skiven kan føre til et fald i mad fosforylering, reduktion i Target genekspression, og vinge mønster defekter12,13. Flere ion-kanaler påvirker udviklingen af Drosophila -fløjen og tilhørende strukturer14,15. Disse ion-kanaler kan også være involveret i DPP-udgivelse. Ved fastsættelsen af mekanismen i morphogen frigivelse, er det vigtigt, at der er en metode til at visualisere frigivelse begivenheder.
DRs. Aurelio Teleman og Stephen Cohen skabte et DPP-GFP-fusionsprotein, der kan redde tab af DPP, hvilket betyder, at det er biologisk aktivt og frigives på en biologisk relevant måde16. Her beskriver vi, hvordan vi visualiserer DPP-udgivelses hændelser ved hjælp af denne DPP-GFP. Dette fusionsprotein er især nyttigt, fordi GFP er pH-følsom, således at fluorescensen slukkes17, når det er i sure vesikler. Når et protein mærket med GFP frigives fra et vesikel til det mere neutrale ekstracellulære miljø, øger GFP-fluorescens intensitet17. Vi udnyttede GFP ‘ pH-følsomhed til at afgøre, om DPP-GFP bor i sure vesikler. Vi afbildet vinge skiver udtrykker DPP-gfp før og efter tilsætning af ammoniumklorid, som neutraliserer intracellulære rum vesikler18. Vi fandt en signifikant stigning i fluorescens af punkta efter tilsætning af ammoniumklorid, hvilket tyder på, at intracellulær DPP-GFP er slukket før tilsætning af ammoniumklorid18. Vi konkluderer, at intracellulære DPP-GFP bor i sure membranbundne rum, såsom vesikler, og er slukket ved tilsætning af ammoniumklorid for at neutralisere pH af intracellulære rum18. Dette gør levende billeddannelse af DPP-GFP en nyttig teknik til at visualisere dynamikken i DPP i Drosophila Wing disc, da det er frigivet fra sure rum i det ekstracellulære miljø.
Her beskriver vi den metode, vi bruger til at visualisere DPP-udgivelses hændelser ved hjælp af DPP-GFP. DPP-GFP kan udtrykkes i sit oprindelige mønster i Drosophila Wing discs ved hjælp af UAS-GAL4 system19. Dette er den metode, der blev brugt til at bestemme, at irk-kanaler påvirker DPP Release18. Vi validerede metoden ved Live-imaging z-stakke. Vi kan ikke se DPP-GFP punkta bevæger sig inden for det plan af fokus i Time Series, hvis vi har erhvervet i et plan af fokus. Vi kan heller ikke se bevægelsen af DPP-gfp punkta, hvis vi afbildet i en z-stak. Vi konkluderer, at DPP-GFP punkta set ved hjælp af denne metode er frigivelse hændelser snarere end flytning af vesikler intracellulært. Denne metode til Live-imaging af DPP-gfp kunne potentielt bruges til at teste andre formodede modifikatorer af DPP frigivelse for deres indvirkning på DPP dynamik eller kunne ændres til at se på dynamikken i andre ligander
Protocol
Representative Results
Discussion
BMPs som DPP gør deres betydelige indflydelse, når de binder et kompleks af membranbundne receptorer til at forårsage en kaskade af intracellulære signalering i tilstødende eller tilsyneladende fjerne celler. Dr. Thomas kornbergs laboratorium har vist, at celler, der producerer DPP signal kontakt celler, der modtager signalet ved hjælp af actin baseret tynde filapodia-lignende strukturer kaldet cytonemes15,24,25. Disse dat…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Dr. Sarala Pradhan for at have arbejdet på en tidligere version af denne protokol. Vi vil gerne takke NSF-IOS 1354282 for finansiering, mens vi udviklede denne protokol. Vi vil gerne takke NIH-NIDCR RO1DE025311 for at finansiere vores laboratorium i øjeblikket.
Materials
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
Riferimenti
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo. Cell. 71 (3), 451-461 (1992).
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo. Development. 114 (3), 583-597 (1992).
- Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo. Development. 117 (2), 807-822 (1993).
- Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila. Genetica. 139 (1), 241-254 (1995).
- Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary. Development. 113 (1), 27-33 (1991).
- Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. An extensive 3′ cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila. Development. 111 (3), 657-666 (1991).
- de Celis, J. F. Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing. Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Letsou, A., et al. Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family. Cell. 80 (6), 899-908 (1995).
- Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic. Cell. 78 (2), 225-237 (1994).
- Raftery, L. A., Sutherland, D. J. TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads. Biologia dello sviluppo. 210 (2), 251-268 (1999).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Dahal, G. R., et al. An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning. Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).
- George, L. F., et al. Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster. G3. 9 (4), 999-1008 (2019).
- Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Glutamate signaling at cytoneme synapses. Science. 363 (6430), 948-955 (2019).
- Teleman, A. A., Cohen, S. M. Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc. Cell. 103 (6), 971-980 (2000).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Hazegh, K. E., Reis, T. A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (117), e54744 (2016).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic. Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332 (6027), 354-358 (2011).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Cytonemes as specialized signaling filopodia. Development. 141 (4), 729-736 (2014).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Communicating by touch–neurons are not alone. Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).
