Sortie d'imagerie Dpp d'un disque d'aile de Drosophila
Summary
Le moment de l’exposition aux ligands peut avoir une incidence sur leurs conséquences sur le développement. Ici, nous montrons comment la libération d’image d’une protéine morphogène osseuse Drosophila (BMP) appelée Dpp à partir de cellules du disque d’aile.
Abstract
La superfamille transformante du facteur de croissance-bêta (TGF-MD) est essentielle pour le modelage embryonnaire précoce et le développement des structures adultes dans les organismes multicellulaires. La superfamille de TGF-MD comprend le TGF-MD, la protéine morphogénétique osseuse (BMP), les activines, les facteurs de croissance et de différenciation et les nodals. On sait depuis longtemps que la quantité de ligand exposée aux cellules est importante pour ses effets. On pensait que les gradients de concentration à longue portée ont établi un motif embryonnaire. Cependant, récemment, il est devenu clair que le moment de l’exposition à ces ligands est également important pour leurs conséquences transcriptionnelles en aval. Un ligand superfamilial TGF-MD ne peut pas avoir de conséquence sur le développement tant qu’il n’est pas libéré de la cellule dans laquelle il a été produit. Jusqu’à récemment, il était difficile de déterminer quand ces ligands ont été libérés des cellules. Ici, nous montrons comment mesurer la libération d’un BMP Drosophila appelé Decapentaplegic (Dpp) à partir des cellules du primordium de l’aile ou du disque d’aile. Cette méthode pourrait être modifiée pour d’autres systèmes ou ligands de signalisation.
Introduction
Les protéines morphogénétiques osseuses (BMP) sont essentielles pour l’embryogenèse précoce et le modelage des structures adultes. Les BMP sont produits et sécrétés pour affecter la transcription des gènes cibles nécessaires à la croissance et à la différenciation cellulaire dans les cellules qui répondent. Decapentaplegic (Dpp) est un homolog Drosophila de BMP4 qui est important pour le développement de structures embryonnaires et adultes comme l’aile1,2,3,4. Plusieurs groupes se sont concentrés sur le rôle de Dpp dans le modelage des ailes de mouche adultes parce que 1) les ailes sont composées de deux feuilles d’épithélie transparentes avec un modèle de vénérisation cohérent qui peut être facilement évalué; 2) les disques d’aile sont également raisonnablement plats, peuvent être cultivés en dehors de la larve, et sont simples à imager et quantifier les différences dans le modèle ; et 3) le développement du modèle d’aile est sensible à Dpp de telle sorte que de petites perturbations dans la voie auront un impact sur le modèle de vénation des ailes.
Dpp est produit dans des cellules situées dans la limite antérieure/postérieure du disque d’aile5,6,7,8. Dpp se lie à un complexe de type 1 et de type 2 récepteurs de sérine/thréonine kinase9,10. Sur la liaison Dpp, le récepteur de type 2 phosphoryle le récepteur de type 1 qui phosphorylate ensuite Mothers against Dpp (Mad), un homolog Smad 1/5/8. Phosphorylated SMAD recrute un co-Smad supplémentaire (Médée), qui lui permet d’entrer dans le noyau où il régule les gènes cibles, conduisant à des effets en aval tels que la prolifération ou la différenciation4,11.
Récemment, le Laboratoire Bates a montré que la libération incorrecte de Dpp dans le disque d’aile peut conduire à une diminution de la phosphorylation mad, la réduction de l’expression des gènes cibles, et les défauts de modelage des ailes12,13. Plusieurs canaux ioniques ont un impact sur le développement de l’aile Drosophila et des structures associées14,15. Ces canaux ioniques pourraient également être impliqués dans la version Dpp. Pour déterminer le mécanisme de la libération du morphogène, il est important qu’il existe une méthode pour visualiser les événements de libération.
Les Drs Aurelio Teleman et Stephen Cohen ont créé une protéine de fusion Dpp-GFP qui est capable de sauver la perte de Dpp, ce qui signifie qu’elle est biologiquement active et est libérée d’une manière biologiquement pertinente16. Ici, nous décrivons comment nous visualisons les événements de sortie Dpp à l’aide de ce Dpp-GFP. Cette protéine de fusion est particulièrement utile parce que le GFP est sensible au pH de telle sorte que lorsqu’il est dans les vésicules acides, la fluorescence est éteinte17. Par conséquent, lorsqu’une protéine étiquetée avec le GFP est libérée d’une vésicule dans l’environnement extracellulaire plus neutre, l’intensité de fluorescence de GFP augmente17. Nous avons profité de la sensibilité de pH de GFP pour déterminer si Dpp-GFP réside dans les vésicules acides. Nous avons photographié des disques d’aile exprimant Dpp-GFP avant et après l’ajout de chlorure d’ammonium, qui neutralise les vésicules des compartiments intracellulaires18. Nous avons constaté une augmentation significative de la fluorescence de la poncte après l’ajout de chlorure d’ammonium, suggérant que le Dpp-GFP intracellulaire soit éteint avant l’ajout de chlorure d’ammonium18. Nous concluons que le Dpp-GFP intracellulaire réside dans les compartiments membranaires acides, tels que les vésicules, et est non éteint à l’ajout de chlorure d’ammonium pour neutraliser le pH des compartiments intracellulaires18. Cela fait de l’imagerie en direct de Dpp-GFP une technique utile pour visualiser la dynamique de Dpp dans le disque d’aile Drosophila comme il est libéré des compartiments acides dans l’environnement extracellulaire.
Ici, nous décrivons la méthode que nous utilisons pour visualiser les événements de sortie Dpp à l’aide de Dpp-GFP. Dpp-GFP peut être exprimé dans son modèle natif dans les disques d’aile Drosophila en utilisant le système UAS-GAL419. C’est la méthode qui a été utilisée pour déterminer que les canaux Irk impact Dpp communiqué18. Nous avons validé la méthode par des z-stacks en direct.imagerie. Nous ne voyons pas Dpp-GFP puncta se déplacer dans le plan de mise au point dans les séries chronologiques si nous avons acquis dans un plan de mise au point. Nous ne voyons pas non plus le mouvement de Dpp-GFP puncta si nous avons imaginé dans un z-stack. Nous concluons que la puncta dpp-GFP vue utilisant cette méthode sont des événements de libération plutôt que le mouvement des vésicules intracellulaires. Cette méthode d’imagerie en direct de Dpp-GFP pourrait potentiellement être utilisée pour tester d’autres modificateurs putatifs de la libération de Dpp pour leur impact sur la dynamique Dpp ou pourrait être modifiée pour examiner la dynamique d’autres ligands
Protocol
Representative Results
Discussion
Les BMP tels que Dpp font leur impact significatif quand ils lient un complexe de récepteurs liés de membrane pour causer une cascade de signalisation intracellulaire dans les cellules voisines ou apparemment lointaines. Le laboratoire du Dr Thomas Kornberg a montré que les cellules qui produisent les cellules de contact de signal Dpp qui reçoivent le signal en utilisant des structures minces à base d’actine filapodia appelées cytonemes15,24,<sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier la Dre Sarala Pradhan d’avoir travaillé sur une version antérieure de ce protocole. Nous tenons à remercier NSF-IOS 1354282 pour le financement pendant que nous éduquions ce protocole. Nous tenons à remercier NIH-NIDCR RO1DE025311 pour le financement de notre laboratoire actuellement.
Materials
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
Riferimenti
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