本手稿的目的是为 RING 型 E3 泛性白化酶的综合生化和功能研究提供大纲。此多步骤管道,具有详细的协议,验证被测试蛋白质的酶活性,并演示如何将活动与功能联系起来。
泛化作为蛋白质的翻译后修饰,在真核细胞的平衡中起着重要的调节作用。76种氨基酸泛性基辛修饰剂与靶蛋白的共价附着,取决于多聚基丁链的长度和拓扑结构,可导致从蛋白质降解到改性蛋白质定位和/或活性变化等不同结果。三种酶依次催化泛化过程:E1泛基质激活酶、E2泛性联因结合酶和E3泛基丁结合酶。E3泛基辛结合酶决定基质特异性,因此代表一个非常有趣的研究课题。在这里,我们提出了一个全面的方法,研究酶活性和功能之间的关系的RING型E3泛性联结酶。此四步协议描述了 1) 如何通过针对保守的 RING 域的站点定向诱变生成 E3 连带缺乏突变体;2⁄3) 如何检查体外和植物体中的泛化活性;4) 如何将这些生化分析与被测试蛋白质的生物意义联系起来。生成E3型缺乏附联物突变体,该突变体仍与其基质相互作用,但不再用于降解,有助于测试体内的酶-基质相互作用。此外,保守的RING域中的突变通常具有占主导地位的负表型,可用于功能敲除研究,作为RNA干扰方法的替代方法。我们的方法经过优化,以研究植物寄生线虫效应器RHA1B的生物作用,它劫持了植物细胞中的宿主泛化系统,以促进寄生。通过对体内表达系统稍作修改,该协议可应用于任何RING型E3连体的分析,无论其来源如何。
绝大多数的E3泛基蛋白属于RING(R eally Iinin ine n e)型蛋白质。环指域最初是由弗里蒙特等人识别的。1和功能描述为域中介蛋白-蛋白质相互作用2。规范的环指是一种特殊类型的锌协调域,定义为由 8 个保存的 Cys (C) 和他的 (H) 组成的共识序列,具体由其他氨基酸残留物 (X)、 C-X2-C-X9+39-C-X1+3-H-X2+3-C/H-X2-C-X4+48-C-X2 -C-C-X 2 -C-X – C-X 2 -C-C-X 2-C-X。两个 Zn2+离子通过独特的”交叉支撑”拓扑通过独特的”交叉支撑”拓扑稳定,C1/C2和 C/H5/C6协调第一个 Zn2+离子,而 C3/H4和 C7/C8绑定第二个 (图 1A)3,4。根据第五个Zn2+协调位点中C或H的存在,定义了环指蛋白的两个规范子类:C3HC4和C3H2C3(环-HC和环-H2)。由于E3泛素结合酶的环环域介导E2结合酶和基质之间的相互作用,这些必需的C和H残留物的突变已被证明会破坏结合酶活性5。还描述了另外五个不太常见的环 E3 利气亚类 (RING-v、 环-C2、 环-D、环-S/T 和环-G)6。RING型E3泛基体酶可进一步细分为简单和复杂的E3酶。简单的单亚单元环 E3 利气包含基板识别位点和 E2 绑定环域。相比之下,多子单元 RING 型 E3 复合体要么招募基板,要么将 E2-泛基质中间体与 E3 复合体进行中介结合。作为自泛化的主要泛泛物附着位点(s)的环域Lys残留物对于E3附着酶活动可能也很重要。
并非所有含环蛋白都作为E3利气蛋白发挥作用。因此,对环指域的生物信息预测和E2依赖性蛋白质的泛化能力必须经过生物化学验证,并链接到被测蛋白质的生物作用。在这里,我们描述了一个分步协议,概述如何通过位点定向诱变方法,在体外和植株中检测环型E3泛性利类气体的酶活性并表征功能。显示此管道的代表性结果,用于环型 E3 连带 RHA1B。RHA1B是植物寄生囊肿线虫球菌皮脂产生的一种效应蛋白,用于抑制植物免疫力,操纵植物根细胞的形态。为了保护自己免受病原体/寄生虫入侵,植物已经进化出核苷酸结合领域和富含亮氨酸的重复(NB-LRR)型免疫受体,检测病原体或寄生虫的存在,并因此产生高敏反应(HR),这是一种在感染地点发生的快速和局部细胞死亡,以阻止病原体的殖民化。其中一种免疫受体是马铃薯Gpa2蛋白,它能抵抗G.pallida(田间种群D383和D372)的一些分离物7。
使用提出的协议,最近发现RHA1B通过靶向植物Gpa2免疫受体进行泛化和降解8,以E3依赖性的方式干扰植物免疫信号。
阐明RING型E3泛基的生化和力学基础,有助于我们理解其在发育、应力信号和平衡维持中的生物学意义。这里描述的方案将诱变方法与体外和植物功能研究结合。通过在环域的保存残留物中引入单一氨基酸替代,通过位点直接诱变,可以同时测试产生的E3缺乏突变体与野生型蛋白质,将酶活性与功能联系起来。
正确识别环域至关重要,尤其是其保存的 Cys 及其残留物。在线工具,如PROSITE可用于做到这一点10。为了破坏负责招募E2酶的RING域的稳定,Cys通常被Ser取代,这是其最接近的结构替代物,缺乏创建用于锌协调的二硫化物键的能力。Lorick等人表明,这些关键Cys残留物中的突变将消除单亚单位RING型E3利气5的泛化活性。虽然一些Cys残留物对于含有RING型蛋白质的多单元E3连体复合物也很重要,但由于这些泛化复合物的多面和动态的三维结构以及RING型蛋白的不同作用,在多单元E3连体中,环域中保存的残留物的单一替代尚未成功产生一个缺乏环状的表型11。
对于位点导向的诱变,我们发现使用更小的质粒载体和较低的扩增周期通常能提高诱变效率。Pfu酶可以替代任何其他高保真和高工艺性DNA聚合酶。此外,如果感兴趣的基因含有稀有的科顿,另一种大肠杆菌染色,罗塞塔,可用于实现重组蛋白的更高产量。此外,还可以进一步优化IPTG诱导的孵育时间和温度。较低的温度降低大肠杆菌分裂率,这可能有利于某些蛋白质的表达。虽然IPTG浓度较高可以改善蛋白质表达,但它也抑制大肠杆菌分裂过程,不建议这样做。
单亚单位环型E3利气不仅作为分子支架的作用,将E2-Ub中间体定位在靠近基板的位置,而且还刺激其共性E2的泛基体转移活性。此外,鉴于E2/E3组合对于决定改性基板命运的多聚二苯链的长度和连接非常重要,因此对环型E3的任何考虑都必须包括其酶伙伴E2s12。如图3B所示,并非所有经过测试的E2都与RHA1B连带相容。因此,体外泛化检测应与代表不同E2类的多个E2酶并行进行,以避免误阴性结果。
这里介绍的是体外酶测定,检测已测试的RING型蛋白质的自我渗透能力。然而,通过小的修改,该协议可以很容易地适应检测基质的体外普及。为此,步骤2.15的体外泛化混合物应补充潜在E3结合基质(500 ng)的重组蛋白。在30°C孵育2小时后,应使用15μL的抗HA亲和基质基质(如果使用HA-Ub,如果使用FLAG-Ub)通过搅拌在4°C下搅拌2小时捕获泛化蛋白。使用冷 Ub 洗涤缓冲液(20 mM Tris pH 7.5、100 mM NaCl、0.1 mM EDTA、0.05% 补间 20、1x PMSF)洗涤珠子 4 次后,丢弃缓冲液的 40 μL,并移动到步骤 2.16。由分别由表位标记Ub和基质的抗体检测的泛化信号,分别从基质蛋白的分子量中产生,确认基质/酶特异性。
此外,由于瞬态酶-基质相互作用和泛化靶蛋白的快速降解,体内E3结合基质的鉴定通常与多重挑战相关。使用E3连体缺乏突变体,它仍然与其目标相互作用,但不再泛化它13,是一个非常有用的替代添加蛋白酶抑制剂MG132,并不总是充分干扰26S蛋白酶体功能。
RING型E3气的一个常见特征是形成和发挥作用作为同质和/或异体。有趣的是,在环域的保守残留物的替代通常与一个显性负表型相关,其中突变的RING型E3连体块酶活性的原生野生类型蛋白质13。因此,在植物中过度表达环突变体可能是敲出E3连体基因的替代方法。
The authors have nothing to disclose.
我们的工作是由美国农业部国家粮食和农业研究所、美国农业部-NIFA农场法案、西北马铃薯协会提供的财政支持(2017-67014-26197;2017-67014-26591)提供的。联盟,和ISDA特种作物。
Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Amylose resin | NEB | E8021S | |
ATP | Sigma-Aldrich | A1852 | |
Bacterial protease inhibitor | Sigma-Aldrich | P8465 | |
Bromphenol Blue | VWR | 97061-690 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Centrifuge | Beckman Coulter | model: Avanti J-25 | |
Commassie Blue | VWR | 97061-738 | |
Creatine phosphate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | |
DNA clean & concentrator Kit | ZYMO RESEARCH | D4029 | |
DpnI | NEB | R0176S | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
E. coli BL21 | Thermo Fisher Scientific | C600003 | |
E. coli DH5α competent cells | Thermo Fisher Scientific | 18265017 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 324504 | |
FeSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | |
FLAG-Ub | BostonBiochem | U-120 | |
Glucose | VWR | 188 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
HA-Ub | BostonBiochem | U-110 | |
Heat block | VWR | model: 10153-318 | |
Incubator | VWR | model: 1525 Digital Incubator | |
Incubator shaker | Thermo Fisher Scientific | model: MaxQ 4000 | |
IPTG | Roche | 10724815001 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
LB Broth | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Liquide nitrogen | university chemistore | ||
Maltose | Sigma-Aldrich | 63418 | |
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63138 | |
MgSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | model: 5424 | |
Miniprep plasmid purification kit | ZYMO RESEARCH | D4015 | |
monoclonal anti-FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | |
monoclonal anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H9658 | |
monoclonal anti-MYC antibody | Sigma-Aldrich | WH0004609M2 | |
Mortar | VWR | 89038-144 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | model: 2000 Spectrophotometer | |
Needle | Thermo Fisher Scientific | 14-826-5C | |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
PCR machine | Bio-Rad | model: C1000 | |
Pestle | VWR | 89038-160 | |
Pfu Ultra | Agilent Technologies | 600380 | |
Plant protease inhibitor coctail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
pMAL-c2 | NEB | N8076S | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
Polyvinylpolypyrrolidone | Sigma-Aldrich | P6755 | |
SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
Sonicator | Qsonica Sonicators | model: Q125 | |
Syringe | Thermo Fisher Scientific | 22-253-260 | |
Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
T4 ligase | NEB | M0202S |