Formålet med dette manuskript er at fremlægge en skitse til de omfattende biokemiske og funktionelle undersøgelser af RING typen E3 ubiquitin-ligaser. Denne flertrinsrørledning, med detaljerede protokoller, validerer en enzymatisk aktivitet af det testede protein og demonstrerer, hvordan aktiviteten knyttes til funktion.
Allestedsnærværende, som en post translationel modifikation af proteiner, spiller en vigtig regulerende rolle i homøostase af eukaryote celler. Den kovalente fastgørelse af 76 aminosyre ubiquitin-modifikatorer til et målprotein, afhængigt af længden og topologien af polyubiquitin-kæden, kan resultere i forskellige resultater, der spænder fra protein nedbrydning til ændringer i lokalisering og/eller aktivitet af modificeret protein. Tre enzymer sekventielt katalyserer den allestedsnærværende proces: E1 ubiquitin-aktiverende enzym, E2 ubiquitin-konjugering enzym, og E3 ubiquitin Ligase. E3 ubiquitin ubiquitinligase afgør substratspecificitet og repræsenterer derfor et meget interessant Studieemne. Her præsenterer vi en omfattende tilgang til at studere forholdet mellem den enzymatiske aktivitet og funktion af RING-typen E3 ubiquitin Ligase. Denne fire-trins protokol beskriver 1) hvordan man genererer en E3 ubiquitinligase mangelfuld mutant gennem site-instrueret mutagenese rettet mod det bevaret RING domæne; 2 – 3) hvordan man undersøger den allestedsnærværende aktivitet både in vitro og i planta; 4) hvordan man knytter disse biokemiske analyser til den biologiske betydning af det testede protein. Generering af en E3 Ligase-mangelfuld mutant, der stadig interagerer med dets substrat, men ikke længere allestedsnærværende det til nedbrydning letter testning af enzym-substrat interaktioner in vivo. Desuden giver mutationen i det bevaret RING domæne ofte en dominerende negativ fænotype, der kan udnyttes i funktionelle knockout-studier som en alternativ tilgang til en RNA-interferens tilgang. Vores metoder blev optimeret til at undersøge den biologiske rolle af planten parasitisk fyrretræsnematoden Effector RHA1B, som kaprer værten allestedsnærværende system i planteceller for at fremme parasitismen. Med en mindre ændring af in vivo-udtryks systemet kan denne protokol anvendes til analyse af alle RING type E3-ubiquitinligase, uanset dens oprindelse.
Langt størstedelen af E3 ubiquitin-ligaser tilhører ring (Rer interesting NEW Gene)-type proteiner. RING finger-domænet blev oprindeligt identificeret af Freemont et al. 1 og funktionelt beskrevet som et domæne, der medierer protein-protein interaktion2. Den kanoniske RING finger er en særlig type af zink koordinerende domæne defineret som en konsensus sekvens af otte bevaret cys (C) og hans (H) specifikt fordelt på andre aminosyre rester (X), C-X2-c-x9 – 39-c-x1 – 3-H-x2 – 3-c/H-x2-c-x4 – 48-c-x2-c. To Zn2 + ioner stabiliseres af Core c-og H-rester gennem en unik topologi med c1/c2 og c/H5/c6 , der koordinerer den første Zn2 + ion, hvorimod C3/h4 og c7/c8 binder den anden (figur 1A)3,4. Afhængigt af tilstedeværelsen af enten C eller H i femte Zn2 +-koordinations sted, blev to kanoniske underklasser af ring finger proteiner defineret: C3HC4 og C3H2C3 (henholdsvis ring-HC og ring-H2). Da RING domænet for E3 ubiquitin ubiquitinligase formidler interaktionen mellem E2 konjugerende enzymer og substrater, har mutation af disse essentielle C-og H-rester vist sig at forstyrre ligaseaktiviteten5. Der er beskrevet yderligere fem mindre almindeligt forekommende underklasser af RING E3-ligaser (RING-v, RING-C2, RING-D, RING-S/T og RING-G)6. RING typen E3 ubiquitin-ligaser kan yderligere opdeles i simple og komplekse E3-enzymer. Den simple enkelt underenhed RING E3 ligaser indeholder både substratet anerkendelse site og E2-binding RING domæne. Derimod er den multi underenhed RING-type E3 kompleks enten rekrutteres substrat eller medierer binding af E2-ubiquitin mellemliggende til E3-komplekset. RING domænet lys rest (r), der fungerer som et primært ubiquitin-fastgørelsessted (er) til selv-allestedsnærværende, kan også være vigtigt for E3-ligaseaktiviteten.
Ikke alle RING-holdige proteiner fungerer som E3-ligaser. Den bioinformatiske forudsigelse af RING finger-domænet og kapaciteten for E2-afhængig protein allestedsnærværende skal således være biokemisk valideret og knyttet til det testede protein’s biologiske rolle. Her beskriver vi en trin-for-trin-protokol, der skitserer, hvordan man detekterer og funktionelt karakteriserer den enzymatiske aktivitet af ring-type E3 ubiquitinligaser, både in vitro og i planta, gennem en site-instrueret mutagenese tilgang. De repræsentative resultater fra denne pipeline vises for RING type E3 ubiquitinligase RHA1B. RHA1B er en Effector protein produceret af planten parasitisk cyste fyrretræsnematoden Globodera pallida at undertrykke plante immunitet og manipulere morfologien af planten rodceller. For at beskytte sig mod patogen/parasitat invasion, planter har udviklet nucleotid-binding domæne og leucin-rige gentage (NB-LRR) immun receptorer, der detekterer tilstedeværelsen af et patogen eller parasit og, som følge heraf, udvikle overfølsom respons (HR), som er en form for hurtig og lokaliseret celledød forekommer på infektionsstedet at arrestere kolonisering af patogener. En sådan immun receptor er kartoffel Gpa2 protein, der giver resistens over for nogle isolater af G. pallida (felt populationer D383 og D372)7.
Ved hjælp af de præsenterede protokoller, er det for nylig blevet konstateret, at RHA1B interfererer med plante immun signalering i en E3-afhængige måde ved at målrette planten Gpa2 immunoreceptor for allestedsnærværende og nedbrydning8.
At belyse det biokemiske og mekaniske grundlag for RING type E3 ubiquitin-ligaser kan i høj grad bidrage til vores forståelse af deres biologiske betydning i udvikling, stress signalering og vedligeholdelse af homøostase. Den her beskrevne protokol par en mutagenese tilgang med in vitro og i planta funktionelle undersøgelser. Ved at indføre en enkelt aminosyresubstitution i de rester af RING domænet, der bevares, gennem site-Direct mutagenese, kan den resulterende E3-mangelfuld mutant testes parallelt med vildt type protein for at forbinde enzymatisk aktivitet med funktionalitet.
Det er afgørende for korrekt at identificere RING domænet, især dets bevaret cys og hans rester. Online værktøjer såsom PROSITE kan bruges til at gøre det10. For at destabilisere RING domænet, der er ansvarligt for rekruttering af E2-enzymet, erstattes cys normalt med ser, som er dets nærmeste strukturelle udskiftning, som mangler evnen til at skabe en disulfid-obligation, der anvendes til zink koordination. Lorick et al. viste, at mutationen i nogen af disse kritiske cys-rester ville afskaffe den allestedsnærværende aktivitet i de enkelte under enheds RING-type E3-ligaser5. Selv om nogle cys-rester også er vigtige for stat-E3 ligasekomplekser, der indeholder ring type proteiner, skyldes den mangesidede og dynamiske tredimensionale struktur af disse allestedsnærværende komplekser og den forskellige rolle af ring type proteiner, at enkelte udskiftninger af bevaret restkoncentrationer i ring domænet i multi Unit E3 ubiquitinligase ikke har haft succes med at generere en ubiquitinligase mangelfuld fæ
For den site-instrueret mutagenese, vi fandt, at ved hjælp af mindre plasmid vektorer og lavere amplifikation cyklusser normalt gav højere effektivitet for mutagenese. PFU-enzymet kan erstattes med enhver anden high-fidelity og høj processivitet DNA-Polymerase. Desuden, hvis genet af interesse indeholder sjældne codons, en anden E. coli plet, Rosetta, kan bruges til at opnå højere udbytte af det rekombinante protein. Derudover kan både inkubationstiden og temperaturen for IPTG-induktion optimeres yderligere. Lavere temperaturer reducere E. coli division sats, som kan være gunstige for ekspression af visse proteiner. Selv om højere koncentration af IPTG kunne forbedre protein ekspression, det hæmmer også E. coli division processer og anbefales ikke.
Enkelt-under enheds RING type E3-ligaser fungerer ikke kun som et Molekylær stilladset, der placerer E2-UB-mellem produktet i umiddelbar nærhed af substratet, men stimulerer også ubiquitin-overførselsaktiviteten i deres E2s. Da en E2/E3-kombination er vigtig for længden og sammenhængen i polyubiquitin-kæden, der afgør et modificeret substrat skæbne, skal enhver overvejelse af RING type E3s desuden omfatte deres enzymatiske partnere, E2s12. Som vist i figur 3Ber ikke alle TESTEDE E2s kompatible med RHA1B Ligase. Derfor bør in vitro-allestedsnærværende assays transporteres parallelt med flere E2-enzymer, der repræsenterer forskellige E2-klasser for at undgå falsk negative resultater.
Præsenteret her er den in vitro enzymatiske assay, der registrerer selv-allestedsnærværende evne af testede RING-type proteiner. Men med små modifikationer, denne protokol kan let tilpasses til påvisning in vitro allestedsnærværende af substrater. Til dette formål bør den in vitro-allestedsnærværende blanding fra trin 2,15 suppleres med det rekombinante protein af det potentielle E3-ligasesubstrat (500 ng). Efter en inkubation på 2 timer ved 30 °C bør allestedsnærværende proteiner opsamles med 15 μL anti-HA-affinitets matrix (hvis der anvendes HA-UB eller anti-FLAG-affinitets matrix, hvis FLAG-UB anvendes) ved agitation i 2 timer ved 4 °C. Efter vask perlerne 4X gange med den kolde UB vask buffer (20 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, 1x PMSF), kassere alle, men 40 μL af bufferen og flytte til trin 2,16. Det allestedsnærværende signal, detekteret af antistoffer, der er specifikke for epitope-mærkede UB og substrat, der er fremspirende fra molekylvægten af substrat proteinet, bekræfter substrat/enzym specificiteten.
Desuden er identifikation af E3 ubiquitinligase substrater in vivo normalt forbundet med flere udfordringer på grund af forbigående enzym substrat interaktion og hurtig nedbrydning af allestedsnærværende målprotein. Ved hjælp af en E3 ubiquitinligase mangelfuld mutant, som stadig interagerer med sit mål, men ikke længere allestedsnærværende det13, er et meget nyttigt alternativ til tilsætning af proteasomal inhibitor MG132, som ikke altid tilstrækkeligt interfererer med 26s proteasomet funktion.
Et almindeligt kendetegn ved RING type E3-ligaser er en tendens til at danne og fungere som homo-og/eller Heterodimere. Interessant, substitution i de bevaret rester af RING domænet er normalt forbundet med en dominerende negativ fænotype, hvor muteret RING-type E3 ubiquitinligase blokke enzymatisk aktivitet af en Native Wild type protein13. Således over ekspression af RING mutanter i planta kan være en alternativ tilgang til at banke ud E3 ubiquitinligase genet.
The authors have nothing to disclose.
Vores arbejde blev muliggjort af den finansielle støtte fra landbrugs-og fødevare forskningsinitiativet konkurrence tilskud (2017-67014-26197; 2017-67014-26591) af USDA National Institute of Food and Agriculture, USDA-NIFA Farm Bill, nordvestlige kartoffel Og ISDA-Special afgrøden.
Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Amylose resin | NEB | E8021S | |
ATP | Sigma-Aldrich | A1852 | |
Bacterial protease inhibitor | Sigma-Aldrich | P8465 | |
Bromphenol Blue | VWR | 97061-690 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Centrifuge | Beckman Coulter | model: Avanti J-25 | |
Commassie Blue | VWR | 97061-738 | |
Creatine phosphate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | |
DNA clean & concentrator Kit | ZYMO RESEARCH | D4029 | |
DpnI | NEB | R0176S | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
E. coli BL21 | Thermo Fisher Scientific | C600003 | |
E. coli DH5α competent cells | Thermo Fisher Scientific | 18265017 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 324504 | |
FeSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | |
FLAG-Ub | BostonBiochem | U-120 | |
Glucose | VWR | 188 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
HA-Ub | BostonBiochem | U-110 | |
Heat block | VWR | model: 10153-318 | |
Incubator | VWR | model: 1525 Digital Incubator | |
Incubator shaker | Thermo Fisher Scientific | model: MaxQ 4000 | |
IPTG | Roche | 10724815001 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
LB Broth | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Liquide nitrogen | university chemistore | ||
Maltose | Sigma-Aldrich | 63418 | |
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63138 | |
MgSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | model: 5424 | |
Miniprep plasmid purification kit | ZYMO RESEARCH | D4015 | |
monoclonal anti-FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | |
monoclonal anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H9658 | |
monoclonal anti-MYC antibody | Sigma-Aldrich | WH0004609M2 | |
Mortar | VWR | 89038-144 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | model: 2000 Spectrophotometer | |
Needle | Thermo Fisher Scientific | 14-826-5C | |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
PCR machine | Bio-Rad | model: C1000 | |
Pestle | VWR | 89038-160 | |
Pfu Ultra | Agilent Technologies | 600380 | |
Plant protease inhibitor coctail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
pMAL-c2 | NEB | N8076S | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
Polyvinylpolypyrrolidone | Sigma-Aldrich | P6755 | |
SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
Sonicator | Qsonica Sonicators | model: Q125 | |
Syringe | Thermo Fisher Scientific | 22-253-260 | |
Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
T4 ligase | NEB | M0202S |