L’objectif de ce manuscrit est de présenter un aperçu des études biochimiques et fonctionnelles complètes des ligases d’ubiquitine E3 de type RING. Ce pipeline en plusieurs étapes, avec des protocoles détaillés, valide une activité enzymatique de la protéine testée et démontre comment lier l’activité à la fonction.
L’ubiquitination, en tant que modification post-traductionnelle des protéines, joue un rôle réglementaire important dans l’homéostasie des cellules eucaryotes. L’attachement covalent de 76 modificateurs d’ubiquitine d’acide aminé à une protéine cible, selon la longueur et la topologie de la chaîne de polyubiquitine, peut avoir comme conséquence différents résultats s’étendant de la dégradation de protéine aux changements dans la localisation et/ou l’activité des protéine modifiées. Trois enzymes catalysent séquentiellement le processus d’ubiquitination : l’enzyme ubiquiitin-activant E1, l’enzyme e2 ubiquiitin-conjuguée, et la ligase d’ubiquitine d’E3. E3 ubiquitine ligase détermine la spécificité du substrat et, par conséquent, représente un sujet d’étude très intéressant. Ici, nous présentons une approche globale pour étudier la relation entre l’activité enzymatique et la fonction de la ligase d’ubiquitine E3 de type RING. Ce protocole en quatre étapes décrit 1) comment générer un mutant déficient e3 ligase par mutagénèse dirigée par site ciblée sur le domaine RING conservé; 2-3) comment examiner l’activité d’ubiquitination à la fois in vitro et dans le planta; 4) comment lier ces analyses biochimiques à la signification biologique de la protéine testée. La génération d’un mutant déficient e3 qui interagit encore avec son substrat mais ne l’ubiquite plus pour la dégradation facilite l’essai des interactions enzyme-substrat in vivo. En outre, la mutation dans le domaine RING conservé confère souvent un phénotype négatif dominant qui peut être utilisé dans les études fonctionnelles knock-out comme une approche alternative à une approche d’interférence de l’ARN. Nos méthodes ont été optimisées pour étudier le rôle biologique de l’effecteur de nématode parasite des plantes RHA1B, qui détourne le système d’ubiquitination hôte dans les cellules végétales pour promouvoir le parasitisme. Avec une légère modification du système d’expression in vivo, ce protocole peut être appliqué à l’analyse de toute ligase E3 de type RING, quelles que soient ses origines.
La grande majorité des ligases d’ubiquitine E3 appartiennent à RING (Really Interesting New Gene) -type protéines. Le domaine RING-doigt a été identifié à l’origine par Freemont et al. 1 et fonctionnellement décrit comme un domaine de médiation des protéines-protéines interaction2. Le doigt canonique RING est un type spécial de domaine de coordination du zinc défini comme une séquence consensuelle de huit Cys conservés (C) et Son (H) spécifiquement espacé par d’autres résidus d’acides aminés (X), C-X2-C-X9-39-C-X1-3-H-X2-3-C/H-X2-C-X4-48-C-X2-C. Deux ions Zn2 sont stabilisés par les résidus cœur C et H grâce à une topologie unique « cross-brace » avec C1/C2 et C/H5/C6 coordonnant le premier ion Zn2, tandis que C3/H4 et C7/C8 lient la seconde (Figure 1A)3,4. Selon la présence de C ou de H dans le cinquième site de coordination Zn2,deux sous-classes canoniques de protéines RING-doigt ont été définies : C3HC4 et C3H2C3 (RING-HC et RING-H2, respectivement). Parce que le domaine RING de l’E3 ubiquitine ligase médiateur de l’interaction entre les enzymes et les substrats conjugués E2, la mutation de ces résidus essentiels C et H a été montré pour perturber l’activité ligase5. Cinq autres sous-classes moins courantes de ligases RING E3 ont été décrites (RING-v, RING-C2, RING-D, RING-S/T et RING-G)6. Les ligases d’ubiquitine E3 de type RING peuvent être subdivisées en enzymes E3 simples et complexes. Les simples ligases RING E3 de sous-unité unique contiennent à la fois le site de reconnaissance du substrat et le domaine RING reliure E2. En revanche, le complexe E3 multisubunit de type RING est soit le substrat de la recrue, soit la liaison intermédiaire e2-ubiquitin au complexe E3. Le domaine RING Lys résidus (s) qui sert de site d’attachement ubiquitine primaire (s) pour l’auto-ubiquitination pourrait également être important pour l’activité de ligase E3.
Toutes les protéines contenant du RING ne fonctionnent pas comme des ligases E3. Ainsi, la prédiction bioinformatique du domaine RING-doigt et la capacité d’ubiquitination des protéines dépendantes de l’E2 doivent être validées biochimiquement et liées au rôle biologique de la protéine testée. Ici, nous décrivons un protocole étape par étape décrivant comment détecter et caractériser fonctionnellement l’activité enzymatique des ligases d’ubiquitine E3 de type RING, in vitro et dans le planta, par une approche mutagenesis dirigée par le site. Les résultats représentatifs de ce pipeline sont indiqués pour le RHA1B de ligase E3 de type RING. RHA1B est une protéine effectrice produite par le nématode de kyste parasite des plantes Globodera pallida pour supprimer l’immunité des plantes et manipuler la morphologie des cellules racinaires végétales. Pour se protéger contre l’invasion d’agents pathogènes/parasites, les plantes ont évolué dans le domaine liant les nucléotides et les récepteurs immunitaires de type répéter riche en leucine (NB-LRR) qui détectent la présence d’un agent pathogène ou d’un parasite et, par conséquent, développent la réponse hypersensible (HR), qui est une forme de mort cellulaire rapide et localisée sur le site de l’infection pour arrêter la colonisation des agents pathogènes. L’un de ces récepteurs immunitaires est la protéine Gpa2 de la pomme de terre qui confère une résistance à certains isolats de G. pallida (populations de champ D383 et D372)7.
En utilisant les protocoles présentés, il a été récemment constaté que RHA1B interfère avec la signalisation immunitaire des plantes d’une manière E3-dépendante en ciblant la plante Gpa2 immunorécepteur pour l’ubiquitination et la dégradation8.
L’élucidation de la base biochimique et mécaniste des ligases d’ubiquitine de type E3 de RING peut contribuer considérablement à notre compréhension de leur signification biologique dans le développement, la signalisation de stress, et le maintien de l’homéostasie. Le protocole décrit ici couple une approche mutagénèse avec in vitro et dans les études fonctionnelles planta. En introduisant une substitution d’acide aminé unique dans les résidus conservés du domaine RING par mutagénèse directe du site, le mutant E3-déficient résultant peut être testé en parallèle avec la protéine de type sauvage pour lier l’activité enzymatique avec la fonctionnalité.
Il est essentiel d’identifier correctement le domaine RING, en particulier ses Cys conservés et ses résidus. Les outils en ligne tels que PROSITE peuvent être utilisés pour le faire10. Pour déstabiliser le domaine RING responsable du recrutement de l’enzyme E2, Cys est normalement remplacé par Ser, qui est son remplacement structurel le plus proche n’ayant pas la capacité de créer une liaison disulfure utilisée pour la coordination du zinc. Lorick et coll. ont montré que la mutation dans l’un de ces résidus critiques de Cys abolirait l’activité d’ubiquitination des ligases E3 de type RING de type ring de la sous-unité unique5. Bien que certains résidus de Cys soient également importants pour les complexes multiunit e3 ligase contenant des protéines de type RING, en raison de la structure tridimensionnelle multiforme et dynamique de ces complexes d’ubiquitination et du rôle différent des protéines de type RING, les substitutions uniques de résidus conservés dans le domaine RING en ligase E3 multiunitaire n’ont pas réussi à générer un phénotype déficient en ligase11.
Pour la mutagénèse dirigée par le site, nous avons constaté que l’utilisation de petits vecteurs plasmides et de cycles d’amplification plus faibles donnait généralement une plus grande efficacité pour la mutagénèse. L’enzyme Pfu peut être remplacée par n’importe quelle autre polymérase d’ADN haute fidélité et à haute teneur en processivité. En outre, si le gène d’intérêt contient des codons rares, une autre tache d’E. coli, Rosetta, peut être utilisée pour obtenir un rendement plus élevé de la protéine recombinante. En outre, le temps d’incubation et la température pour l’induction IPTG peuvent être encore optimisés. Des températures plus basses réduisent le taux de division d’E. coli, ce qui pourrait être favorable à l’expression de certaines protéines. Bien qu’une concentration plus élevée d’IPTG puisse améliorer l’expression des protéines, elle inhibe également les processus de division d’E. coli et n’est pas recommandée.
Les ligases E3 de type RING sous-unité unique fonctionnent non seulement comme un échafaudage moléculaire qui positionne l’intermédiaire E2-Ub à proximité du substrat, mais stimulent également l’activité de transfert d’ubiquitine de leurs E2 cognates. En outre, étant donné qu’une combinaison E2/E3 est importante pour la longueur et les liens de la chaîne de polyubiquitin qui détermine le sort d’un substrat modifié, toute considération de RING-type E3s doit inclure leurs partenaires enzymatiques, E2s12. Comme le montre la figure 3B, tous les E2 testés ne sont pas compatibles avec la ligase RHA1B. Par conséquent, les essais d’ubiquitination in vitro doivent être effectués en parallèle avec plusieurs enzymes E2 représentant différentes classes E2 afin d’éviter les faux résultats négatifs.
Présenté ici est l’essai enzymatique in vitro qui détecte la capacité d’auto-ubiquitination des protéines testées de type RING. Cependant, avec de petites modifications, ce protocole peut être facilement adapté pour détecter l’ubiquitination in vitro des substrats. À cette fin, le mélange d’ubiquitination in vitro de l’étape 2.15 devrait être complété avec la protéine recombinante du substrat potentiel de ligase E3 (500 ng). À la suite d’une incubation de 2 h à 30 oC, la protéine ubiquitinated doit être capturée à l’aide de 15 l de matrice d’affinité anti-HA (si HA-Ub est utilisé, ou matrice d’affinité anti-FLAG si FLAG-Ub est utilisé) par agitation pendant 2 h à 4 oC. Après avoir lavé les perles 4 fois avec le tampon de lavage Ub froid (20 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, 1x PMSF), jeter tous sauf 40 l de la mémoire tampon et passer à l’étape 2,16. Le signal d’ubiquitination, détecté par des anticorps spécifiques à l’Ub et au substrat étiquetés épitopères, respectivement, émergeant du poids moléculaire de la protéine de substrat, confirme la spécificité du substrat/enzyme.
En outre, l’identification des substrats de ligase E3 in vivo est habituellement associée à de multiples défis dus à l’interaction transitoire enzyme-substrat et à la dégradation rapide de la protéine cible ubiquitinated. L’utilisation d’un mutant déficient E3 ligase, qui interagit toujours avec sa cible, mais ne l’ubiquitine plus13, est une alternative très utile à l’ajout de l’inhibiteur protéasomal MG132, qui n’interfère pas toujours suffisamment avec la fonction protéasome 26S.
Une caractéristique commune des ligases E3 de type RING est une tendance à se former et à fonctionner en tant qu’homo- et/ou hétérodistes. Fait intéressant, la substitution dans les résidus conservés du domaine RING est généralement associée à un phénotype négatif dominant où muté RING-type E3 ligase bloque l’activité enzymatique d’une protéine de type sauvage indigène13. Ainsi, la surexpression des mutants RING dans planta peut être une approche alternative à assommer le gène de ligase E3.
The authors have nothing to disclose.
Notre travail a été rendu possible grâce au soutien financier de la subvention concurrentielle de l’Initiative pour l’agriculture et la recherche alimentaire (2017-67014-26197; 2017-67014-26591) de l’INSTITUT national de l’alimentation et de l’agriculture de l’USDA, du projet de loi agricole de l’USDA-NIFA, de la pomme de terre du Nord-Ouest culture spécialisée ISDA.
Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Amylose resin | NEB | E8021S | |
ATP | Sigma-Aldrich | A1852 | |
Bacterial protease inhibitor | Sigma-Aldrich | P8465 | |
Bromphenol Blue | VWR | 97061-690 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Centrifuge | Beckman Coulter | model: Avanti J-25 | |
Commassie Blue | VWR | 97061-738 | |
Creatine phosphate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | |
DNA clean & concentrator Kit | ZYMO RESEARCH | D4029 | |
DpnI | NEB | R0176S | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
E. coli BL21 | Thermo Fisher Scientific | C600003 | |
E. coli DH5α competent cells | Thermo Fisher Scientific | 18265017 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 324504 | |
FeSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | |
FLAG-Ub | BostonBiochem | U-120 | |
Glucose | VWR | 188 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
HA-Ub | BostonBiochem | U-110 | |
Heat block | VWR | model: 10153-318 | |
Incubator | VWR | model: 1525 Digital Incubator | |
Incubator shaker | Thermo Fisher Scientific | model: MaxQ 4000 | |
IPTG | Roche | 10724815001 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
LB Broth | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Liquide nitrogen | university chemistore | ||
Maltose | Sigma-Aldrich | 63418 | |
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63138 | |
MgSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | model: 5424 | |
Miniprep plasmid purification kit | ZYMO RESEARCH | D4015 | |
monoclonal anti-FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | |
monoclonal anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H9658 | |
monoclonal anti-MYC antibody | Sigma-Aldrich | WH0004609M2 | |
Mortar | VWR | 89038-144 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | model: 2000 Spectrophotometer | |
Needle | Thermo Fisher Scientific | 14-826-5C | |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
PCR machine | Bio-Rad | model: C1000 | |
Pestle | VWR | 89038-160 | |
Pfu Ultra | Agilent Technologies | 600380 | |
Plant protease inhibitor coctail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
pMAL-c2 | NEB | N8076S | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
Polyvinylpolypyrrolidone | Sigma-Aldrich | P6755 | |
SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
Sonicator | Qsonica Sonicators | model: Q125 | |
Syringe | Thermo Fisher Scientific | 22-253-260 | |
Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
T4 ligase | NEB | M0202S |