El objetivo de este manuscrito es presentar un esquema para los estudios bioquímicos y funcionales completos de las ligasinas de ubiquitina tipo RING E3. Esta canalización de varios pasos, con protocolos detallados, valida una actividad enzimática de la proteína probada y demuestra cómo vincular la actividad a la función.
La ubiquitinación, como modificación posttranslacional de las proteínas, desempeña un importante papel regulador en la homeostasis de las células eucariotas. La unión covalente de 76 modificadores de ubiquitina de aminoácidos a una proteína diana, dependiendo de la longitud y topología de la cadena de poliubiquitina, puede resultar en diferentes resultados que van desde la degradación de las proteínas hasta los cambios en la localización y/o actividad de la proteína modificada. Tres enzimas catalizan secuencialmente el proceso de ubiquitinación: enzima activadora de ubiquitina E1, enzima conjugada de ubiquitina E2 y ligasa de ubiquitina E3. La ubiquitina ligaa E3 determina la especificidad del sustrato y, por lo tanto, representa un tema de estudio muy interesante. Aquí presentamos un enfoque integral para estudiar la relación entre la actividad enzimática y la función de la ligasa de ubiquitina tipo RING E3. Este protocolo de cuatro pasos describe 1) cómo generar un mutante deficiente de la ligasa E3 a través de mutagénesis dirigida por el sitio dirigida al dominio RING conservado; 2–3) cómo examinar la actividad de ubiquitinación tanto in vitro como en planta; 4) cómo vincular esos análisis bioquímicos a la importancia biológica de la proteína probada. La generación de un mutante con deficiencia de ligasa E3 que todavía interactúa con su sustrato pero que ya no lo ubiquitiniza para la degradación facilita la prueba de interacciones enzima-sustrato in vivo. Además, la mutación en el dominio RING conservado a menudo confiere un fenotipo negativo dominante que se puede utilizar en estudios funcionales de eliminación como un enfoque alternativo a un enfoque de interferencia de ARN. Nuestros métodos fueron optimizados para investigar el papel biológico del efector de nematodos parásitos de la planta RHA1B, que secuestra el sistema de ubiquitinación del huésped en las células vegetales para promover el parasitismo. Con ligera sin modificaciones del sistema de expresión in vivo, este protocolo se puede aplicar al análisis de cualquier ligadura E3 tipo RING independientemente de sus orígenes.
La gran mayoría de las ligasas de ubiquitina E3 pertenecen a proteínas de tipo RING (Really Interesting New Gene). El dominio RING-finger fue identificado originalmente por Freemont et al. 1 y funcionalmente descrito como un dominio que media la interacción proteína-proteína2. El dedo canónico RING es un tipo especial de dominio de coordinación de zinc definido como una secuencia de consenso de ocho Cys (C) conservados y su (H) espaciados específicamente por otros residuos de aminoácidos (X), C-X2-C-X9–39-C-X1–3-H-X2–3-C/H-X2-C-X4–48-C-X2-C. Dos iones Zn2+ se estabilizan mediante residuos de núcleo C y H a través de una topología única de “cross-brace” con C1/C2 y C/H5/C6 coordinando el primer ion Zn2+, mientras que C3/H4 y C7/C8 enlazan el segundo(Figura 1A)3,4. Dependiendo de la presencia de C o H en el quinto sitio de coordinación Zn2+,se definieron dos subclases canónicas de proteínas RING-finger: C3HC4 y C3H2C3 (RING-HC y RING-H2, respectivamente). Debido a que el dominio RING de la ligasa de ubiquitina E3 media la interacción entre las enzimas y sustratos conjugantes E2, se ha demostrado que la mutación de estos residuos esenciales de C y H interrumpe la actividad de la ligasa5. Se han descrito otras cinco subclases menos comunes de ligasligas RING E3 (RING-v, RING-C2, RING-D, RING-S/T y RING-G)6. Las ligasas de ubiquitina tipo RING E3 se pueden subdividir aún más en enzimas E3 simples y complejas. La sencilla subunidad única RING E3 ligases contiene tanto el sitio de reconocimiento de sustrato sy el dominio RING de unión E2. Por el contrario, el complejo multisubunidad RING tipo E3 o bien recluta el sustrato o media la unión del e2-ubiquitina intermedia al complejo E3. El dominio RING de residuos de Lys que sirve como un sitio o sitios de unión a la ubiquitina primaria para la autoubiquitinación también podrían ser importantes para la actividad de la ligasa E3.
No todas las proteínas que contienen RING funcionan como ligases E3. Por lo tanto, la predicción bioinformática del dominio RING-finger y la capacidad de ubiquitinación de proteínas dependientes de E2 deben ser validadas bioquímicamente y vinculadas al papel biológico de la proteína probada. Aquí, describimos un protocolo paso a paso que describe cómo detectar y caracterizar funcionalmente la actividad enzimática de las ligasinas ubiquitinas tipo RING E3, tanto in vitro como en planta, a través de un enfoque de mutagénesis dirigida por el sitio. Los resultados representativos de esta canalización se muestran para la ligada de tipo RING E3 RHA1B. RHA1B es una proteína efectora producida por el nematodo parasitario de la planta Globodera pallida para suprimir la inmunidad de la planta y manipular la morfología de las células de la raíz de la planta. Para protegerse de la invasión de patógenos/parásitos, las plantas han evolucionado el dominio de unión a nucleótidos y los receptores inmunes de tipo de repetición rica en leucina (NB-LRR) que detectan la presencia de un patógeno o parásito y, como consecuencia, desarrollan la respuesta hipersensible (HR), que es una forma de muerte celular rápida y localizada que ocurre en el sitio de infección para detener la colonización de patógenos. Uno de estos receptores inmunes es la proteína gpa2 de patata que confiere resistencia a algunos aislados de G. pallida (poblaciones de campo D383 y D372)7.
Utilizando los protocolos presentados, se ha encontrado recientemente que RHA1B interfiere con la señalización inmune de la planta de una manera dependiente de E3 al apuntar a la planta Gpa2 inmunoreceptor para la ubiquitinación y degradación8.
Elaclarar la base bioquímica y mecanicista de las ligasas de ubiquitina TIPO RING E3 puede contribuir en gran medida a nuestra comprensión de su importancia biológica en el desarrollo, la señalización del estrés y el mantenimiento de la homeostasis. El protocolo descrito aquí combina un enfoque de mutagénesis con estudios funcionales in vitro y en planta. Mediante la introducción de una única sustitución de aminoácidos en los residuos conservados del dominio RING a través de mutagénesis directa al sitio, el mutante con deficiencia de E3 resultante puede ser probado en paralelo con proteína de tipo silvestre para vincular la actividad enzimática con la funcionalidad.
Es fundamental identificar adecuadamente el dominio RING, en particular sus Cys conservados y Sus residuos. Las herramientas en línea como PROSITE se pueden utilizar para hacerlo10. Para desestabilizar el dominio RING responsable de reclutar la enzima E2, Cys normalmente se sustituye por Ser, que es su reemplazo estructural más cercano que carece de la capacidad de crear un enlace de disulfuro utilizado para la coordinación de zinc. Lorick et al. mostraron que la mutación en cualquiera de esos residuos críticos de Cys aboliría la actividad de ubiquitinación de la subunidad única tipo RING E3 ligases5. Aunque algunos residuos de Cys también son importantes para los complejos de ligasas E3 multiunidad que contienen proteínas de tipo RING, debido a la estructura tridimensional multifacética y dinámica de esos complejos de ubiquitinación y a su diferente papel de las proteínas tipo RING, las sustituciones únicas de residuos conservados en el dominio RING en la ligasa E3 multiunit no ha tenido éxito en la generación de un fenotipo11con deficiencia de ligasa.
Para la mutagénesis dirigida por el sitio, encontramos que el uso de vectores plásmidos más pequeños y ciclos de amplificación más bajos generalmente produjo una mayor eficiencia para la mutagénesis. La enzima Pfu se puede sustituir por cualquier otra polimerasa de ADN de alta fidelidad y alta procesatividad. Además, si el gen de interés contiene codones raros, otra mancha de E. coli, Rosetta, se puede utilizar para lograr un mayor rendimiento de la proteína recombinante. Además, tanto el tiempo de incubación como la temperatura para la inducción IPTG se pueden optimizar aún más. Las temperaturas más bajas reducen la tasa de división de E. coli, lo que podría ser favorable para la expresión de ciertas proteínas. Aunque una mayor concentración de IPTG podría mejorar la expresión de proteínas, también inhibe los procesos de división de E. coli y no se recomienda.
Las ligasas RING de subunidad única tipo E3 no sólo funcionan como un andamio molecular que posiciona el intermedio E2-Ub cerca del sustrato, sino que también estimula la actividad de transferencia de ubiquitina de sus E2 cognados. Además, dado que una combinación E2/E3 es importante para la longitud y los enlaces de la cadena de poliubiquitina que determina el destino de un sustrato modificado, cualquier consideración de los E3 de tipo RING debe incluir a sus socios enzimáticos, E2s12. Como se muestra en la Figura 3B,no todos los E2 probados son compatibles con la ligada RHA1B. Por lo tanto, los ensayos de ubiquitinación in vitro deben llevarse en paralelo con múltiples enzimas E2 que representan diferentes clases E2 para evitar resultados falsos negativos.
Aquí se presenta el ensayo enzimático in vitro que detecta la capacidad de autoubiquitinación de las proteínas de tipo RING probadas. Sin embargo, con pequeñas modificaciones, este protocolo se puede adaptar fácilmente para detectar la ubiquitinación in vitro de sustratos. Para ello, la mezcla de ubiquitinación in vitro del paso 2.15 debe complementarse con la proteína recombinante del potencial sustrato de ligasa E3 (500 ng). Después de una incubación de 2 h a 30 oC, la proteína ubiquitinizada debe capturarse utilizando 15 oL de matriz de afinidad anti-HA (si se utiliza HA-Ub, o matriz de afinidad anti-FLAG si se utiliza FLAG-Ub) por agitación durante 2 h a 4 oC. Después de lavar las perlas 4 veces con el tampón de lavado Ub frío (20 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 0.05% Tween 20, 1x PMSF), deseche todo menos 40 l del tampón y pase al paso 2.16. La señal de ubiquitinación, detectada por anticuerpos específicos del ub etiquetado con epítopos y sustrato, respectivamente, que surge del peso molecular de la proteína del sustrato, confirma la especificidad sustrato/enzima.
Además, la identificación in vivo de sustratos de ligasa E3 se asocia con múltiples desafíos debido a la interacción transitoria enzima-sustrato y la rápida degradación de la proteína diana ubiquitinada. El uso de un mutante deficiente de ligasa E3, que todavía interactúa con su objetivo pero ya no lo ubiquitina13, es una alternativa muy útil a la adición de inhibidor proteasomal MG132, que no siempre interfiere lo suficiente con la función de proteasoma 26S.
Una característica común de las ligasas tipo RING E3 es una tendencia a formar y funcionar como homo- y/o heterodímeros. Curiosamente, la sustitución en los residuos conservados del dominio RING suele estar asociada a un fenotipo negativo dominante en el que la ligasa mutada tipo RING E3 bloquea la actividad enzimática de una proteína nativa de tipo silvestre13. Por lo tanto, la sobreexpresión de los mutantes RING en planta puede ser un enfoque alternativo para eliminar el gen de la ligasa E3.
The authors have nothing to disclose.
Nuestro trabajo fue posible gracias al apoyo financiero de la subvención competitiva de la Iniciativa de Investigación Agrícola y Alimentaria (2017-67014-26197; 2017-67014-26591) del USDA National Institute of Food and Agriculture, USDA-NIFA Farm Bill, Northwest Potato Potato Consorcio, y ISDA Specialty Crop.
Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Amylose resin | NEB | E8021S | |
ATP | Sigma-Aldrich | A1852 | |
Bacterial protease inhibitor | Sigma-Aldrich | P8465 | |
Bromphenol Blue | VWR | 97061-690 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Centrifuge | Beckman Coulter | model: Avanti J-25 | |
Commassie Blue | VWR | 97061-738 | |
Creatine phosphate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | |
DNA clean & concentrator Kit | ZYMO RESEARCH | D4029 | |
DpnI | NEB | R0176S | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
E. coli BL21 | Thermo Fisher Scientific | C600003 | |
E. coli DH5α competent cells | Thermo Fisher Scientific | 18265017 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 324504 | |
FeSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | |
FLAG-Ub | BostonBiochem | U-120 | |
Glucose | VWR | 188 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
HA-Ub | BostonBiochem | U-110 | |
Heat block | VWR | model: 10153-318 | |
Incubator | VWR | model: 1525 Digital Incubator | |
Incubator shaker | Thermo Fisher Scientific | model: MaxQ 4000 | |
IPTG | Roche | 10724815001 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
LB Broth | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Liquide nitrogen | university chemistore | ||
Maltose | Sigma-Aldrich | 63418 | |
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63138 | |
MgSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | model: 5424 | |
Miniprep plasmid purification kit | ZYMO RESEARCH | D4015 | |
monoclonal anti-FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | |
monoclonal anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H9658 | |
monoclonal anti-MYC antibody | Sigma-Aldrich | WH0004609M2 | |
Mortar | VWR | 89038-144 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | model: 2000 Spectrophotometer | |
Needle | Thermo Fisher Scientific | 14-826-5C | |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
PCR machine | Bio-Rad | model: C1000 | |
Pestle | VWR | 89038-160 | |
Pfu Ultra | Agilent Technologies | 600380 | |
Plant protease inhibitor coctail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
pMAL-c2 | NEB | N8076S | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
Polyvinylpolypyrrolidone | Sigma-Aldrich | P6755 | |
SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
Sonicator | Qsonica Sonicators | model: Q125 | |
Syringe | Thermo Fisher Scientific | 22-253-260 | |
Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
T4 ligase | NEB | M0202S |