Identificazione di nuovi regolatori della traspirazione vegetale mediante screening termico su larga scala in Helianthus Annuus
Summary
Forniamo un metodo per identificare i modulatori della traspirazione fogliare mediante lo screening su larga scala di una libreria composta.
Abstract
L’adattamento delle piante alle sollecitazioni biotiche e abiotiche è regolato da una varietà di fattori, tra i quali la regolazione dell’apertura stomatica in risposta al deficit idrico o agli agenti patogeni svolge un ruolo cruciale. L’identificazione di piccole molecole che regolano il movimento stomatale può quindi contribuire a comprendere la base fisiologica con cui le piante si adattano al loro ambiente. Gli approcci di screening su larga scala che sono stati utilizzati per identificare i regolatori del movimento stomatale hanno potenziali limitazioni: alcuni si basano fortemente sul percorso di segnalazione dell’ormone dell’acido asscisico (ABA), escludendo quindi i meccanismi indipendenti dall’ABA, mentre altri si basano sull’osservazione di effetti fisiologici indiretti e a lungo termine come la crescita e lo sviluppo delle piante. Il metodo di screening qui presentato consente il trattamento su larga scala di piante con una biblioteca di sostanze chimiche accoppiate con una quantificazione diretta della loro traspirazione mediante imaging termico. Poiché l’evaporazione dell’acqua attraverso la traspirazione si traduce nel raffreddamento della superficie delle foglie, l’imaging termico fornisce un approccio non invasivo per studiare i cambiamenti nella conduttanza stomatale nel tempo. In questo protocollo, le piantine Helianthus annuus vengono coltivate idroponically e quindi trattate mediante alimentazione della radice, in cui la radice primaria viene tagliata e immersa nella sostanza chimica testata. L’imaging termico seguito dall’analisi statistica delle variazioni di temperatura cotiledonaria nel tempo consente l’identificazione di molecole bioattive che modulano l’apertura stomatale. I nostri esperimenti proof-of-concept dimostrano che una sostanza chimica può essere trasportata dalla radice tagliata al cotileno della piantina di girasole entro 10 minuti. Inoltre, quando le piante vengono trattate con ABA come un controllo positivo, un aumento della temperatura superficiale delle foglie può essere rilevato in pochi minuti. Il nostro metodo consente così l’identificazione efficiente e rapida di nuove molecole che regolano l’apertura stomatale.
Introduction
La tolleranza allo stress nelle piante è un tratto poligenico influenzato da una varietà di caratteristiche molecolari, cellulari, di sviluppo e fisiologiche e meccanismi1. Le piante in un ambiente fluttuante devono modulare continuamente i loro movimenti stomatali per bilanciare la domanda fotosintetica di carbonio pur mantenendo acqua sufficiente e impedendo l’invasione degli agenti patogeni2; tuttavia, i meccanismi con cui vengono prese queste “decisioni” di compromesso sono poco compresi3. L’introduzione di molecole bioattive nelle piante può modulare la loro fisiologia e aiutare a sondare nuovi meccanismi di regolazione.
Lo screening su larga scala di piccole molecole è una strategia efficace utilizzata nella scoperta di farmaci anti-cancro e nei saggi farmacologici per testare gli effetti fisiologici di centinaia-migliaia di molecole in un breve periodo di tempo4,5. Nella biologia vegetale, lo screening ad alto rendimento ha dimostrato la sua efficacia, ad esempio nell’identificazione della molecola sintetica pyrabactin6, così come nella scoperta del recettore a lungo ricercato dell’acido asscissico (ABA)7,8. Da allora, agonisti e antagonisti dei recettori ABA, e piccole molecole in grado di modulare l’espressione dei geni reporter ABA-inducibili sono stati identificati9,10, 11,12,13,14,15. Gli approcci di screening ad alta velocità attualmente disponibili per identificare piccoli composti che possono modulare l’apertura stomatica hanno alcuni inconvenienti: (i) i protocolli che ruotano intorno alla via di segnalazione delle sementi possono impedire l’identificazione di nuovi meccanismi indipendenti dall’ABA e (ii) strategie in vivo utilizzate per l’identificazione di piccole molecole bioattive si basano principalmente sui loro effetti fisiologici sulla germinazione delle sementi o sulla crescita delle sementi, e non sulla regolazione del sepira toro della pianta.
Inoltre, mentre ci sono molti modi per trattare le piante con molecole bioattive, la maggior parte di esse non sono adatte per uno studio su larga scala del movimento stomatale. In breve, le tre tecniche più comuni sono l’applicazione del fogliame spruzzando o immersione, il trattamento del sistema radicale e l’irrigazione delle radici. L’applicazione foliare non è compatibile con le metodologie più comuni e rapide per misurare l’apertura stomatale poiché la presenza di goccioline sulla superficie fogliare interferisce con la raccolta di dati su larga scala. I principali limiti dell’irrigazione delle radici sono i grandi requisiti di volume del campione, la potenziale ritenzione dei composti da parte di elementi nella rizosfera e la dipendenza dall’assorbimento attivo della radice.
Qui, presentiamo un metodo su larga scala per identificare nuovi composti che regolano la traspirazione delle piante che non implica necessariamente meccanismi di risposta alla siccità ABA o noti e consente un trattamento efficiente e affidabile delle piante. In questo sistema, le piante di Helianthus annuus vengono trattate utilizzando un approccio di alimentazione delle radici che consiste nel tagliare la radice primaria delle piantine coltivate idroponicamente e immergere il sito di taglio nella soluzione campione. Una volta trattata, l’effetto di ogni composto sulla traspirazione delle piante viene misurato utilizzando una termocamera a infrarossi. Poiché un fattore determinante della temperatura superficiale della foglia è il tasso di evaporazione dalla foglia, i dati di imaging termico possono essere direttamente correlati alla conduttanza stomatale. Il cambiamento relativo della temperatura del fogliare dopo il trattamento chimico fornisce quindi un mezzo diretto per quantificare la traspirazione dell’impianto.
H. annuus è una delle cinque più grandi colture di semi oleosi nel mondo16 e le scoperte fatte direttamente su questa pianta possono facilitare i futuri trasferimenti di tecnologia. Inoltre, le piantine H. annuus hanno cotiledoni grandi e piatte, così come una spessa radice primaria, che era ideale per lo sviluppo di questo protocollo. Tuttavia, questo metodo può essere facilmente adattato ad altre piante e una varietà di composti.
Questo protocollo può essere utilizzato per identificare efficacemente le molecole in grado di innescare la chiusura stomatale o promuovere l’apertura stomatale, che ha importanti implicazioni per la comprensione dei segnali che regolano la conduttanza stomatale e l’adattamento delle piante all’ambiente Sottolinea.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il numero di composti che possono essere testati in un dato giorno dipende principalmente (i) dallo spazio a controllo ambientale disponibile per far crescere le piante e per eseguire lo schermo, nonché dal numero (ii) del numero di individui che possono essere coinvolti nel passaggio 6 del protocollo. Raccomandiamo l’uso di tre repliche sperimentali per consolidare l’interpretazione dei risultati dopo il trattamento statistico. In una giornata tipo, da uno a due individui possono vagliare 60 composti in triplicati senz…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato sostenuto da Pomona College Start-up Funds e Hirsch Research Initiation Grants Fund (a FJ) così come dal Pomona College Molecular Biology Program attraverso lo Stellar Summer Research Assistant Program (al KG).
Materials
| 1020 plastic growing trays without drain holes | Standard 10 x 20 inch trays | ||
| 2.0 mL microtubes, capless | Genesee Scientific | 22-283NC | |
| Abscisic acid (ABA) | Sigma-Aldrich | A1049 | |
| Air pump | Active Aqua | AAPA7.8L | 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min |
| Airstones | |||
| Chemical compound library | MicroSource Discovery | Natural Product Collection | |
| Creative Versa-Tool (wood burning tool) | Nasco | 9724549 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Dwarf Sunspot Sunflower seeds | Outsidepride.com | ||
| Erythrosin B | Sigma-Aldrich | 200964 | |
| Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) | General Hydroponics | GL51GH1421.31.11 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Laptop | Dell | ||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Microdissection scissors | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| ResearchIR Software | FLIR | ||
| R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board | Insulfoam | ||
| Seedholders | Araponics | N/A | |
| Super Tub (plastic utility tub) | Maccourt | ST3608 | 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics |
| T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera | FLIR | FLIR-T62101 | Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop |
| Vermiculite | |||
| Water filter | SunSun | HW-304B Pro Canister Filter |
Riferimenti
- Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. Plant adaptation to drought stress. F1000Research. 5, (2016).
- McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. Gate control: guard cell regulation by microbial stress. The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).
- Leung, J., Bazihizina, N., Mancuso, S., Valon, C. Revisiting the Plant’s Dilemma. Molecular Plant. 9 (1), 7-9 (2016).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
- Wigglesworth, M. J., Murray, D. C., Blackett, C. J., Kossenjans, M., Nissink, J. W. Increasing the delivery of next generation therapeutics from high throughput screening libraries. Current Opinion in Chemical Biology. 26, 104-110 (2015).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nature Chemical Biology. 3 (11), 716-721 (2007).
- Park, S. Y., et al. Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
- Ma, Y., et al. Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors. Science. 324 (5930), 1064-1068 (2009).
- Cao, M., et al. An ABA-mimicking ligand that reduces water loss and promotes drought resistance in plants. Cell Research. 23 (8), 1043-1054 (2013).
- Okamoto, M., et al. Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12132-12137 (2013).
- Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors. Trends in Plant Science. 20 (6), 330-332 (2015).
- Kim, T. H., et al. Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway. Current Biology. 21 (11), 990-997 (2011).
- Ito, T., et al. Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening. ChemBioChem. 16 (17), 2471-2478 (2015).
- Ye, Y., et al. A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors. Plant Physiology. 173 (4), 2356-2369 (2017).
- Takeuchi, J., et al. Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions. Nature Chemical Biology. 10 (6), 477-482 (2014).
- Rauf, S., et al. Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value. Journal of the Science of Food and Agriculture. 97 (7), 1997-2006 (2017).
- Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Briefings in Bioinformatics. 16 (6), 974-986 (2015).
- Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3937-3949 (2013).
- Merlot, S., et al. Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation. The Plant Journal. 30 (5), 601-609 (2002).
