Identificación de nuevos reguladores de la transpiración de plantas mediante el cribado térmico de imágenes a gran escala en Helianthus Annuus
Summary
Proporcionamos un método para identificar moduladores de transpiración foliar mediante cribado a gran escala de una biblioteca compuesta.
Abstract
La adaptación de las plantas a las tensiones bióticas y abióticas se rige por una variedad de factores, entre los que la regulación de la apertura estomatal en respuesta al déficit de agua o patógenos juega un papel crucial. La identificación de moléculas pequeñas que regulan el movimiento estomatal puede contribuir, por lo tanto, a comprender la base fisiológica por la que las plantas se adaptan a su entorno. Los enfoques de cribado a gran escala que se han utilizado para identificar los reguladores del movimiento estomatal tienen limitaciones potenciales: algunos dependen en gran medida de la vía de señalización hormonal del ácido abscés (ABA), excluyendo así los mecanismos independientes de la ABA, mientras que otros dependen de la observación de efectos fisiológicos indirectos a largo plazo como el crecimiento y desarrollo de las plantas. El método de cribado presentado aquí permite el tratamiento a gran escala de plantas con una biblioteca de productos químicos junto con una cuantificación directa de su transpiración por imágenes térmicas. Dado que la evaporación del agua a través de la transpiración da como resultado un enfriamiento de la superficie de la hoja, las imágenes térmicas proporcionan un enfoque no invasivo para investigar los cambios en la conductancia estomatal a lo largo del tiempo. En este protocolo, las plántulas Helianthus annuus se cultivan hidropónicamente y luego se tratan mediante la alimentación de las raíces, en la que la raíz primaria se corta y se sumerge en el producto químico que se está probando. Las imágenes térmicas seguidas de un análisis estadístico de los cambios de temperatura cotiledóres a lo largo del tiempo permiten la identificación de moléculas bioactivas que modulan la apertura estomatal. Nuestros experimentos de prueba de concepto demuestran que un producto químico se puede llevar desde la raíz cortada hasta el cotilería de la plántula de girasol en 10 minutos. Además, cuando las plantas son tratadas con ABA como un control positivo, se puede detectar un aumento en la temperatura de la superficie de la hoja en cuestión de minutos. Nuestro método permite así la identificación eficiente y rápida de nuevas moléculas que regulan la apertura estomatal.
Introduction
La tolerancia al estrés en las plantas es un rasgo poligénico influenciado por una variedad de características y mecanismos moleculares, celulares, de desarrollo y fisiológicos1. Las plantas en un entorno fluctuante necesitan modular continuamente sus movimientos estomatales para equilibrar la demanda fotosintética de carbono manteniendo el agua suficiente y previniendo la invasión de patógenos2; sin embargo, los mecanismos por los cuales se toman estas “decisiones” de compensación se entienden mal3. La introducción de moléculas bioactivas en las plantas puede modular su fisiología y ayudar a sondear nuevos mecanismos de regulación.
El cribado a gran escala de moléculas pequeñas es una estrategia eficaz utilizada en el descubrimiento de fármacos contra el cáncer y ensayos farmacológicos para probar los efectos fisiológicos de cientos a miles de moléculas en un corto período de tiempo4,5. En biología vegetal, el cribado de alto rendimiento ha demostrado su eficacia, por ejemplo, en la identificación de la molécula sintética pyrabactin6, así como el descubrimiento del receptor de ácido abscístico (ABA)7,8. Desde entonces, agonistas y antagonistas de los receptores ABA, y pequeñas moléculas capaces de modular la expresión de genes reporteros inducibles ABA han sido identificados9,10,11,12,13,14,15. Los enfoques de cribado de alto rendimiento disponibles actualmente para identificar pequeños compuestos que pueden modular la apertura estomatal tienen algunos inconvenientes: (i) los protocolos que giran alrededor de la vía de señalización ABA pueden impedir la identificación de nuevos mecanismos independientes de aba, y (ii) las estrategias in vivo utilizadas para la identificación de moléculas pequeñas bioactivas dependen principalmente de sus efectos fisiológicos sobre la germinación de semillas o el crecimiento de la plántula, y no en la regulación de la transpiración vegetal por se.
Además, aunque hay muchas maneras de tratar las plantas con moléculas bioactivas, la mayoría de ellas no son adecuadas para un estudio a gran escala del movimiento estomatal. En resumen, las tres técnicas más comunes son la aplicación foliar mediante pulverización o inmersión, tratamiento del sistema radicular y riego radicular. La aplicación foliar no es compatible con las metodologías más comunes y rápidas para medir la apertura estomatal ya que la presencia de gotas en la superficie de la hoja interfiere con la recopilación de datos a gran escala. Las principales limitaciones del riego radicular son los grandes requisitos de volumen de muestra, la retención potencial de los compuestos por elementos en la rizosfera, y la dependencia de la toma activa de raíces.
Aquí, presentamos un método a gran escala para identificar nuevos compuestos que regulan la transpiración de plantas que no necesariamente implican mecanismos DE respuesta a la sequía ABA o conocidos y permite un tratamiento eficiente y confiable de las plantas. En este sistema, las plantas de Helianthus annuus son tratadas utilizando un enfoque de alimentación de raíces que consiste en cortar la raíz primaria de las plántulas cultivadas hidropónicamente y sumergir el sitio de corte en la solución de la muestra. Una vez tratado, el efecto de cada compuesto en la transpiración de las plantas se mide utilizando una cámara termográfica infrarroja. Dado que un determinante importante de la temperatura de la superficie de la hoja es la tasa de evaporación de la hoja, los datos de imágenes térmicas pueden correlacionarse directamente con la conductancia estomatal. El cambio relativo en la temperatura foliar después del tratamiento químico proporciona así un medio directo para cuantificar la transpiración de la planta.
H. annuus es uno de los cinco mayores cultivos de semillas olea-oilenales en el mundo16 y los descubrimientos realizados directamente en esta planta pueden facilitar futuras transferencias de tecnología. Además, las plántulas H. annuus tienen cotiledón grande y plano, así como una gruesa raíz primaria, que era ideal para el desarrollo de este protocolo. Sin embargo, este método se puede adaptar fácilmente a otras plantas y una variedad de compuestos.
Este protocolo se puede utilizar para identificar eficazmente moléculas capaces de desencadenar el cierre estomatal o promover la apertura estomatal, lo que tiene implicaciones importantes para entender las señales que regulan la conductividad estomatal y la adaptación de las plantas al medio ambiente Tensiones.
Protocol
Representative Results
Discussion
El número de compuestos que se pueden probar en un día determinado depende principalmente de (i) el espacio ambientalmente controlado disponible para el cultivo de las plantas y para realizar la pantalla, así como (ii) el número de individuos que pueden participar en el paso 6 del protocolo. Recomendamos el uso de tres réplicas experimentales para consolidar la interpretación de los resultados después del tratamiento estadístico. En un día típico, uno a dos individuos pueden examinar 60 compuestos en triplicado…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo fue apoyado por Pomona College Start-up Funds y Hirsch Research Initiation Grants Fund (to FJ) así como el Programa de Biología Molecular de Pomona College a través del Programa Estelar de Asistente de Investigación de Verano (a KG).
Materials
| 1020 plastic growing trays without drain holes | Standard 10 x 20 inch trays | ||
| 2.0 mL microtubes, capless | Genesee Scientific | 22-283NC | |
| Abscisic acid (ABA) | Sigma-Aldrich | A1049 | |
| Air pump | Active Aqua | AAPA7.8L | 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min |
| Airstones | |||
| Chemical compound library | MicroSource Discovery | Natural Product Collection | |
| Creative Versa-Tool (wood burning tool) | Nasco | 9724549 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Dwarf Sunspot Sunflower seeds | Outsidepride.com | ||
| Erythrosin B | Sigma-Aldrich | 200964 | |
| Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) | General Hydroponics | GL51GH1421.31.11 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Laptop | Dell | ||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Microdissection scissors | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| ResearchIR Software | FLIR | ||
| R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board | Insulfoam | ||
| Seedholders | Araponics | N/A | |
| Super Tub (plastic utility tub) | Maccourt | ST3608 | 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics |
| T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera | FLIR | FLIR-T62101 | Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop |
| Vermiculite | |||
| Water filter | SunSun | HW-304B Pro Canister Filter |
Riferimenti
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