Antibiotika-Dereplication ved hjælp af antibiotikaresistens platformen
Summary
Vi beskriver en platform, der udnytter et bibliotek af isogene antibiotikaresistente Escherichia coli til dereplication af antibiotika. Identiteten af et antibiotikum produceret af bakterier eller svampe kan udledes af væksten af E. coli udtrykker sin respektive resistens gen. Denne platform er økonomisk effektiv og tidsbesparende.
Abstract
En af de største udfordringer i søgningen efter nye antibiotika fra naturlige produkt ekstrakter er genopdagelsen af fælles forbindelser. For at imødegå denne udfordring udføres dereplication, som er processen med at identificere kendte forbindelser, på prøver af interesse. Metoder til dereplication såsom analytisk adskillelse efterfulgt af massespektrometri er tidskrævende og ressourcekrævende. For at forbedre dereplication proces, har vi udviklet antibiotikaresistens platform (ARP). ARP er et bibliotek med ca. 100 antibiotikaresistensgener, der er blevet individuelt klonet til Escherichia coli. Denne stamme samling har mange applikationer, herunder en omkostningseffektiv og facile metode til antibiotika dereplication. Processen involverer gæring af antibiotika-producerende mikrober på overfladen af rektangulære Petri skåle, der indeholder fast medium, hvilket giver mulighed for sekretion og diffusion af sekundære metabolitter gennem mediet. Efter en 6 dages fermenterings periode fjernes den mikrobielle biomasse, og der tilsættes en tynd agar-overlay til Petri skålen for at skabe en glat overflade og muliggøre væksten af E. coli -indikator stammerne. Vores samling af ARP stammer derefter fastgjort på overfladen af antibiotika-holdige Petri skål. Pladen er næste inkuberet natten for at tillade E. coli vækst på overfladen af overlay. Kun stammer, der indeholder resistens over for et bestemt antibiotikum (eller klasse), vokser på denne overflade, hvilket muliggør hurtig identifikation af det producerede stof. Denne metode er med held blevet anvendt til identifikation af producenter af kendte antibiotika og som et middel til at identificere dem, der producerer nye forbindelser.
Introduction
Siden opdagelsen af penicillin i 1928, naturlige produkter afledt af miljømæssige mikroorganismer har vist sig at være en rig kilde til antimikrobielle forbindelser1. Ca. 80% af natur produktets antibiotika stammer fra bakterier af slægten Streptomyces og andre actinomycetes, mens de resterende 20% produceres af svampearter1. Nogle af de mest almindelige antibiotika stilladser, der anvendes i klinikken, såsom β-lactams, tetracyclines, rifamyciner, og aminoglykosider, blev oprindeligt isoleret fra mikrober2. Men på grund af stigningen af multiresistente (mdr) bakterier, vores nuværende panel af antibiotika er blevet mindre effektiv i behandling3,4. Disse omfatter “ESKAPE”-patogener (dvs. vancomycin-resistente enterokokker og β-lactam-resistent Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanniiog Enterobacter Sp.), som er en delmængde af bakterier, der anses for at være forbundet med den højeste risiko af en række store offentlige sundhedsmyndigheder som Verdenssundhedsorganisationen3,4,5. Fremkomsten og den globale udbredelse af disse mdr-patogener resulterer i et konstant behov for nye antibiotika3,4,5. Desværre har de sidste to årtier vist, at opdagelsen af nye antibiotika fra mikrobielle kilder bliver stadig vanskeligere6. De nuværende tilgange til Drug Discovery omfatter høj gennemløb screening af bioaktive forbindelser, herunder naturlige produkt ekstrakt biblioteker, giver mulighed for tusindvis af ekstrakter, der skal testes på et givet tidspunkt2. Men, når antimikrobiel aktivitet opdages, det næste skridt er at analysere indholdet af den rå ekstrakt til at identificere den aktive komponent og eliminere dem, der indeholder kendte eller overflødige forbindelser7,8. Denne proces, benævnt dereplication, er afgørende for at forebygge og/eller væsentligt reducere den tid, der bruges på re-opdagelse af kendte antibiotika7,9. Selv om et nødvendigt skridt i naturlige produkt Drug opdagelse, dereplication er notorisk omstændelig og ressourcekrævende10.
Lige siden Beutler et al. først opfundet udtrykket “dereplication”, er der gjort en stor indsats for at udvikle innovative strategier for hurtig identifikation af kendte antibiotika11,12. I dag omfatter de mest almindeligt anvendte værktøjer til dereplication analytiske kromatografiske systemer såsom højtydende væskekromatografi, massespektrometri og nukleare magnet resonans baserede detekteringsmetoder11,13. Desværre, hver af disse metoder kræver brug af dyrt analytisk udstyr og sofistikeret data fortolkning.
I et forsøg på at udvikle en dereplication metode, der kan hurtigt udføres uden specialiseret udstyr, vi etablerede antibiotikaresistens platform (ARP)10. ARP kan bruges til opdagelsen af antibiotika adjuvanter, profilering af nye antibiotika forbindelser mod kendte resistensmekanismer, og dereplication af kendte antibiotika i ekstrakter afledt af aktinobakterier og andre mikrober. Her fokuserer vi på dets anvendelse i antibiotika-dereplication. ARP udnytter et bibliotek af isogene Escherichia coli stammer udtrykker individuelle resistensgener, der er effektive mod de mest almindeligt genfundne antibiotika14,15. Når e. coli -biblioteket dyrkes i nærværelse af en sekundær metabolit-producerende organisme, kan identiteten af forbindelsen udledes af væksten af e. coli -stammer, der udtrykker dens associerede resistens gen10. Da ARP først blev indberettet, bestod biblioteket af > 40 gener, som giver resistens over for 16 antibiotika klasser. Den oprindelige dereplication skabelon var designet til at omfatte en delmængde af resistensgener per antibiotika klasse til at give oplysninger om antibiotika under klasse under dereplication proces. I dag består ARP af > 90 gener, der giver resistens over for 18 antibiotika klasser. Ved hjælp af vores omfattende samling af resistensgener er der udviklet en sekundær dereplication-skabelon, som er kendt som den minimale antibiotikaresistens platform (MARP). Denne skabelon blev oprettet for at eliminere genredundans og blot give oplysninger om den generelle antibiotika klasse, som en dereplicated metabolit er relateret til. Derudover besidder marp-skabelonen både dværg og en hyperpermeabel/efflux mangelfuld stamme af e. coli BW25113 (e. coli BW25113 δbambδTolc), sammenlignet med den oprindelige inkarnation af ARP, som kun udnytter den hyperpermeable stamme. Dette unikke aspekt skaber yderligere fænotyper under dereplication, hvilket indikerer en forbindelser evne til at krydse den ydre membran af gram-negative bakterier. Her beskriver vi en robust protokol, der skal følges, når dereplicating med enten ARP og/eller MARP, fremhæve de mest kritiske skridt, der skal følges, og diskutere de forskellige mulige resultater.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den ovenfor beskrevne protokol kan anvendes på både opdagelsen af nye antimikrobielle forbindelser og adjuvanter, der kan anvendes sammen med eksisterende antibiotika for at redde deres aktivitet. Platformen udnytter de høje substratspecificitet af resistensmekanismer og deres cognate antibiotika, at dereplicate forbindelser inden for rå naturlige produkt ekstrakter. Selv om den tid, der kræves for afkalknings plader, der skal forberedes, er langvarig (~ 2 uger), er selve dereplications processen afsluttet efter en …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i Wright Lab vedrørende ARP/MARP blev støttet af Ontario Research fund og canadiske institutter for sundhedsforskning Grant (FRN-148463). Vi vil gerne anerkende sommer Chou for at hjælpe med udvidelse og organisering af ARP-biblioteket.
Materials
| Agar | Bio Shop | AGR003.5 | |
| AlumaSeal CS Films for cold storage | Sigma-Aldrich | Z722642-50EA | |
| Ampicillin Sodium Salt | Bio Shop | AMP201.100 | |
| BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton Dickinson | 212322 | |
| BBL Phytone Peptone (Soytone) | Becton Dickinson | 211906 | |
| Calcium Carbonate | Bio Shop | CAR303.500 | |
| Casamino acid | Bio Basic | 3060 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| CryoPure Tube 1.8ml mix.colour | Sarstedt | 72.379.992 | |
| D-glucose | Bio Shop | GLU501.5 | |
| Disposable Culture Tube, 16x100mm | Fisher Scientific | 14-961-29 | |
| Ethyl Alcohol Anhydrous | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Glass Beads, Solid | Fisher Scientific | 11-312C | |
| Glycerol | Bio Shop | GLY001.4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Instant sealing sterilization pouch | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Iron (II) Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich | F7002-250G | |
| Kanamycin Sulfate | Bio Shop | KAN201.50 | |
| LB Broth Lennox | Bio Shop | LBL405.500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | M63-500 | |
| MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size | Millipore-Sigma | HAWP00010 | 10 FT roll, hydrophillic, white, plain |
| Microtest Plate 96 well, round base | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| New Brunswick Innova 44 | Eppendorf | M1282-0000 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 264728 | with lid, sterile, non treated |
| Petri dish 92x16mm with cams | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Pinning tools | ETH Zurich | – | Custom order |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potato starch | Bulk Barn | 279 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium Nitrate | Fisher Scientific | S343-500 | |
| Wood Applicators | Dukal Corporation | 9000 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 |
Riferimenti
- Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R., Dhanasekaran, D., Jiang, Y. Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria. Basics and Biotechnological Applications. , (2016).
- Thaker, M. N., et al. Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance. Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).
- Gajdács, M. The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design. Molecules. 24, 892 (2019).
- Boucher, H. W., et al. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).
- Gajdács, M. The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antibiotics. 8, 52 (2019).
- Gaudêncio, S. P., Pereira, F. Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process. Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).
- Ito, T., Masubuchi, M. Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies. The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).
- Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. Dereplication and Partial Identification of Natural Products. Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).
- Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R., Roessner, U., Dias, D. A. Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products. Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. , 227-244 (2013).
- Cox, G., et al. A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).
- Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
- Beutler, J. Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus. Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).
- Mohimani, H., et al. Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra. Nature Communications. 9, 1-12 (2018).
- Baltz, R. H. Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).
- Baltz, R. H. Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall. Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).
