एंटीबायोटिक प्रतिरोध मंच का उपयोग एंटीबायोटिक Dereplication
Summary
हम एक मंच है कि एंटीबायोटिक दवाओं के dereplication के लिए isogenic एंटीबायोटिक प्रतिरोधी Escherichia कोलाई के एक पुस्तकालय का इस्तेमाल का वर्णन. बैक्टीरिया या कवक द्वारा उत्पादित एंटीबायोटिक की पहचान ई. कोलाई के विकास से कम हो सकती है जो अपने संबंधित प्रतिरोध जीन को व्यक्त करती है। यह मंच आर्थिक रूप से प्रभावी और समय-कुशल है।
Abstract
प्राकृतिक उत्पाद के अर्क से नए एंटीबायोटिक दवाओं के लिए खोज में मुख्य चुनौतियों में से एक आम यौगिकों की फिर से खोज है. इस चुनौती से निपटने के लिए, dereplication, जो ज्ञात यौगिकों की पहचान करने की प्रक्रिया है, ब्याज के नमूने पर किया जाता है. इस तरह के बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के बाद विश्लेषणात्मक जुदाई के रूप में dereplication के लिए तरीके समय लेने वाली और संसाधन गहन हैं। dereplication प्रक्रिया में सुधार करने के लिए, हम एंटीबायोटिक प्रतिरोध मंच (एआरपी) विकसित किया है. एआरपी लगभग 100 एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन है कि व्यक्तिगत रूप से Escherichia कोलाई में क्लोन किया गया है की एक पुस्तकालय है. इस तनाव संग्रह एंटीबायोटिक dereplication के लिए एक लागत प्रभावी और सुगम विधि सहित कई आवेदन किया है. इस प्रक्रिया में ठोस माध्यम से युक्त आयताकार पेट्री व्यंजनों की सतह पर एंटीबायोटिक उत्पादक रोगाणुओं का किण्वन शामिल है, जिससे माध्यम के माध्यम से माध्यमिक चयापचयों के स्राव और प्रसार के लिए अनुमति दी जाती है। एक 6 दिन किण्वन अवधि के बाद, माइक्रोबियल बायोमास हटा दिया जाता है, और एक पतली agar-ओवरले एक चिकनी सतह बनाने के लिए और ई. कोलाई सूचक उपभेदों के विकास को सक्षम करने के लिए पेट्री डिश में जोड़ा जाता है। एआरपी उपभेदों के हमारे संग्रह तो एंटीबायोटिक युक्त पेट्री पकवान की सतह पर टिकी है. प्लेट अगले रात incubated है ओवरले की सतह पर ई कोलाई विकास के लिए अनुमति देने के लिए. केवल एक विशिष्ट एंटीबायोटिक (या वर्ग) के लिए प्रतिरोध युक्त उपभेदों इस सतह पर विकसित उत्पादन यौगिक की तेजी से पहचान को सक्षम करने. इस विधि को सफलतापूर्वक ज्ञात एंटीबायोटिक दवाओं के उत्पादकों की पहचान के लिए और एक साधन के रूप में उपन्यास यौगिकों का उत्पादन उन की पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया है.
Introduction
सन् 1928 में पेनिसिलिन की खोज के बाद से पर्यावरणीय सूक्ष्मजीवों से प्राप्त प्राकृतिक उत्पाद एंटीमाइक्रोबियल यौगिकोंकासमृद्ध स्रोत सिद्ध हुए हैं। लगभग 80% प्राकृतिक उत्पाद एंटीबायोटिक ्सीट्स स्ट्रेप्टोमाइसेस और अन्य एक्टिनोमाइसेट्स के बैक्टीरिया से प्राप्त होते हैं, जबकि शेष 20% कवक प्रजातियों1द्वारा उत्पादित होता है। क्लिनिक में इस्तेमाल किए जाने वाले सबसे आम एंटीबायोटिक पाड़ों में से कुछ जैसे कि जेड-लैक्टम्स, टेट्रासाइक्लिन, रिफामाइसिन, और एमिनोग्लीकोसाइड, मूल रूप से रोगाणुओं से अलग किए गए थे2। तथापि, बहुऔषध प्रतिरोधी (एमडीआर) बैक्टीरिया की वृद्धि के कारण, एंटीबायोटिक दवाओं का हमारा वर्तमान पैनल उपचार3,4में कम प्रभावी हो गया है। इनमें “ESKAPE” रोगजनक (यानी, वैन्कोमीसिन-प्रतिरोधी आंत्रकि और जेड-लैक्टम-प्रतिरोधी स्टेफिलोकोकस ऑरियस, क्लेब्सिएला न्यूमोनिया, स्यूडोमोनास एरुजिनोसा, ऐसिन्टोबैक्टर बाउमैनी, और Enterobacter sp.), जो बैक्टीरिया का एक सबसेट है जो विश्व स्वास्थ्य संगठन3,4,5जैसे कई प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य अधिकारियों द्वारा सबसे अधिक जोखिम के साथ जुड़ा हुआ माना जाता है. इन एमडीआर रोगजनकों के उद्भव और वैश्विक प्रसार के परिणामस्वरूप उपन्यासएंटीबायोटिक3,4,5की निरंतर आवश्यकता होती है . अफसोस की बात है, पिछले दो दशकों से पता चला है कि माइक्रोबियल स्रोतों से उपन्यास एंटीबायोटिक दवाओं की खोज तेजी से मुश्किल6है . दवा की खोज के लिए वर्तमान दृष्टिकोण bioactive यौगिकों के उच्च throughput स्क्रीनिंग शामिल हैं, प्राकृतिक उत्पाद निकालने पुस्तकालयों सहित, अर्क के हजारों के लिए एक दिए गए समय में परीक्षण किया जा करने के लिए अनुमति2. तथापि, एक बार एंटीमाइक्रोबियल गतिविधि का पता लगने के बाद, अगला चरण सक्रिय घटक की पहचान करने के लिए कच्चे तेल के अर्क की सामग्री का विश्लेषण करना और ज्ञात या अनावश्यक यौगिकों वाले यौगिकों को समाप्त करनाहै। इस प्रक्रिया, dereplication के रूप में जाना जाता है, को रोकने के लिए महत्वपूर्णहै और / हालांकि प्राकृतिक उत्पाद दवा की खोज में एक आवश्यक कदम, dereplication कुख्यात परिश्रमी और संसाधन गहन10है.
जब से Beutler एट अल पहली बार शब्द “dereplication” गढ़ा, व्यापक प्रयास ज्ञात एंटीबायोटिक दवाओं की तेजी से पहचान के लिए अभिनव रणनीति विकसित करने के लिए किए गए हैं11,12. आज dereplication के लिए इस्तेमाल किया सबसे आम उपकरण इस तरह के उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री, और परमाणु चुंबकीय अनुनाद आधारित पता लगाने के तरीकों11,13के रूप में विश्लेषणात्मक क्रोमैटोग्राफी प्रणाली शामिल हैं। दुर्भाग्य से, इन तरीकों में से प्रत्येक महंगी विश्लेषणात्मक उपकरण और परिष्कृत डेटा व्याख्या के उपयोग की आवश्यकता है.
एक dereplication विधि है कि तेजी से विशेष उपकरणों के बिना किया जा सकता है विकसित करने के प्रयास में, हम एंटीबायोटिक प्रतिरोध मंच (एआरपी)10की स्थापना की. एआरपी एंटीबायोटिक सहायकों की खोज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, ज्ञात प्रतिरोध तंत्र के खिलाफ नए एंटीबायोटिक यौगिकों की रूपरेखा, और actinobacteria और अन्य रोगाणुओं से व्युत्पन्न अर्क में ज्ञात एंटीबायोटिक दवाओं के dereplication. यहाँ, हम एंटीबायोटिक dereplication में अपने आवेदन पर ध्यान केंद्रित. एआरपी आइसोजेनिक एस्चेरीचिया कोली के एक पुस्तकालय का उपयोग करता है जो व्यक्तिगत प्रतिरोध जीनों को व्यक्त करता है जो सबसे अधिक पुनः खोजे गए एंटीबायोटिक दवाओं14,15 केखिलाफ प्रभावी होते हैं . जब ई. कोलाई पुस्तकालय एक द्वितीयक मेटाबोलाइट उत्पादक जीव की उपस्थिति में उगाया जाता है, यौगिक की पहचान ई. कोलाई उपभेदों है कि अपने संबद्ध प्रतिरोध जीन10व्यक्त के विकास से deduced किया जा सकता है. जब एआरपी पहली बार रिपोर्ट किया गया था, पुस्तकालय में शामिल थे और 40 जीन 16 एंटीबायोटिक वर्गों के लिए प्रतिरोध प्रदान. मूल dereplication टेम्पलेट dereplication प्रक्रिया के दौरान एंटीबायोटिक उपवर्ग के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए एंटीबायोटिक वर्ग प्रति प्रतिरोध जीन का एक सबसेट शामिल करने के लिए डिजाइन किया गया था. आज, एआरपी के शामिल है और 90 जीन है कि 18 एंटीबायोटिक वर्गों के लिए प्रतिरोध प्रदान. प्रतिरोध जीन के हमारे व्यापक संग्रह का उपयोग करना, एक माध्यमिक dereplication टेम्पलेट विकसित किया गया है और कम से कम एंटीबायोटिक प्रतिरोध मंच (MARP) के रूप में जाना जाता है. इस टेम्पलेट जीन अतिरेक को खत्म करने के लिए और बस सामान्य एंटीबायोटिक वर्ग है कि एक dereplicated चयापचय से संबंधित है के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए बनाया गया था. इसके अतिरिक्त, एमआरपी टेम्पलेट के पास एआरपी के मूल अवतार की तुलना में वाइल्डटाइप और हाइपरपरमेबल/efflux की कमी तनाव ई. कोलाई BW25113(ई. कोलाई BW25113 ]bamB[tolC)दोनों के पास है, जो केवल अति पारगम्य तनाव का इस्तेमाल करता है. इस अनूठी पहलू dereplication के दौरान अतिरिक्त phenotypes बनाता है, ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया की बाहरी झिल्ली को पार करने के लिए एक यौगिकों की क्षमता का संकेत. यहाँ, हम एक मजबूत प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए जब या तो एआरपी और /
Protocol
Representative Results
Discussion
ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल उपन्यास एंटीमाइक्रोबियल यौगिकों और सहायकों की खोज दोनों पर लागू किया जा सकता है जिनका उपयोग मौजूदा एंटीबायोटिक दवाओं के साथ उनकी गतिविधि को बचाने के लिए किया जा सकता है। मंच प्र?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ARP/MARP से संबंधित राइट प्रयोगशाला में अनुसंधान ओंटारियो अनुसंधान कोष और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान अनुदान के संस्थानों (FRN-148463) द्वारा समर्थित किया गया था. हम विस्तार और एआरपी पुस्तकालय के संगठन में सहायता के लिए Sommer Chou स्वीकार करना चाहते हैं.
Materials
| Agar | Bio Shop | AGR003.5 | |
| AlumaSeal CS Films for cold storage | Sigma-Aldrich | Z722642-50EA | |
| Ampicillin Sodium Salt | Bio Shop | AMP201.100 | |
| BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton Dickinson | 212322 | |
| BBL Phytone Peptone (Soytone) | Becton Dickinson | 211906 | |
| Calcium Carbonate | Bio Shop | CAR303.500 | |
| Casamino acid | Bio Basic | 3060 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| CryoPure Tube 1.8ml mix.colour | Sarstedt | 72.379.992 | |
| D-glucose | Bio Shop | GLU501.5 | |
| Disposable Culture Tube, 16x100mm | Fisher Scientific | 14-961-29 | |
| Ethyl Alcohol Anhydrous | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Glass Beads, Solid | Fisher Scientific | 11-312C | |
| Glycerol | Bio Shop | GLY001.4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Instant sealing sterilization pouch | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Iron (II) Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich | F7002-250G | |
| Kanamycin Sulfate | Bio Shop | KAN201.50 | |
| LB Broth Lennox | Bio Shop | LBL405.500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | M63-500 | |
| MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size | Millipore-Sigma | HAWP00010 | 10 FT roll, hydrophillic, white, plain |
| Microtest Plate 96 well, round base | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| New Brunswick Innova 44 | Eppendorf | M1282-0000 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 264728 | with lid, sterile, non treated |
| Petri dish 92x16mm with cams | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Pinning tools | ETH Zurich | – | Custom order |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potato starch | Bulk Barn | 279 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium Nitrate | Fisher Scientific | S343-500 | |
| Wood Applicators | Dukal Corporation | 9000 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 |
Riferimenti
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