分化人类单细胞衍生巨噬细胞中细胞外陷阱释放的体外刺激与可视化

Summary

这里介绍的是一种使用显微镜和荧光染色检测活细胞培养中巨噬细胞外陷阱 （MET） 生产的协议。此方案可进一步扩展，通过免疫荧光染色检查特定的 MET 蛋白标记物。

Abstract

嗜中性粒细胞释放细胞外陷阱（ETs）已被确定为导致慢性炎症相关疾病发展的一个因素。中性粒细胞（NETs）由DNA、组蛋白和各种颗粒蛋白（即骨髓过氧化物酶、电感酶和卡西普辛G）组成的网状物组成。其他免疫细胞，包括巨噬细胞，也可以产生ET;然而，这在体内发生的程度，以及巨噬细胞外陷阱（METs）是否在病理机制中发挥作用，尚未得到详细研究。为了更好地了解MET在炎症性病理中的作用，开发了一种方案，用于在体外可视化来自原发性人类巨噬细胞的MET释放，在免疫荧光实验中也可以加以利用。这允许进一步描述这些结构，并将其与从嗜中性粒细胞释放的ET进行比较。人类单细胞衍生巨噬细胞（HMDM）在接触不同炎症刺激后，在M1亲炎表型分化后产生MET。MET的释放可以通过显微镜可视化，使用绿色荧光核酸染色，不透过活细胞（例如，SYTOX绿色）。使用新鲜分离的原生巨噬细胞（如 HMDM）有利于模拟与潜在临床应用相关的体内炎症事件。该协议还可用于研究从人类单细胞细胞系（例如，THP-1）的MET释放后分化为巨噬细胞与磷酸酯或其他巨噬细胞系（例如，鼠巨噬细胞一样的J774A.1细胞）。

Introduction

从嗜中性粒细胞释放的ET首先被确定为由细菌^感染1触发的先天免疫反应。它们由DNA骨干组成，各种具有抗菌特性的颗粒蛋白被结合，包括嗜中性乳酸酶和骨髓过氧化物^酶2。中性粒细胞（NETs）的主要作用是捕获病原体并促进其^消除3。然而，除了ETs在免疫防御中的保护作用外，越来越多的研究也发现了疾病发病机制的作用，特别是在炎症驱动型疾病（即风湿性关节炎和动脉粥样硬化⁴。ET的释放可以由各种亲炎细胞因子触发，包括白细胞介素8（IL-8）和肿瘤坏死因子α（TNF+）5，6，并且ET的局部积累可以增加组织损伤，并引起亲炎^反应7。例如，ET被牵连为在动脉粥样^硬化8的发展，促进血栓^形成9，和预测心血管^风险10的因果作用。

现在人们认识到，除了嗜中性粒细胞外，其他免疫细胞（即乳腺细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞）也可以在暴露于微生物或亲炎^{刺激11、12}时释放ETs。考虑到巨噬细胞在慢性炎症疾病的发展、调节和解决中的重要作用，这可能在巨噬细胞方面特别重要。因此，有必要更好地了解从巨噬细胞中释放ET与炎症相关疾病发展之间的潜在关系。最近的研究表明，在完整的人类动脉粥样硬化斑块和有组织的^血栓13中存在MET和NET。类似地，METS也涉嫌通过调节炎症^反应14来驱动肾损伤。然而，与嗜中性粒细胞相比，关于巨噬细胞的MET形成机制的数据有限。最近使用MET形成人类体外模型的研究表明，每种细胞类型（即缺乏巨噬细胞组蛋白的细胞）所涉及的途径存在一些^差异。然而，一些已经表明，NET释放也可以发生在没有组蛋白^{的切口15。}

该协议的总体目标是提供一种简单而直接的方法，在临床相关的巨噬菌体模型中评估MET释放。有许多不同的体外巨噬细胞模型，已用于研究METs（即，THP-1人类单细胞细胞系和各种鼠巨噬细胞^系）16。这些模型存在一些限制。例如，THP-1单核细胞与巨噬细胞的分化通常需要一个启动步骤，例如添加醋酸磷酸酯（PMA），它本身激活蛋白质激酶C（PKC）依赖通路。此过程已知可触发 ET 释放^4，并产生 THP-1 细胞的低基底 MET 释放。其他研究也突显了与PMA处理的THP-1^细胞17相比，体内巨噬细胞在生物活性和炎症反应方面的差异。

同样，不同鼠群状细胞系的行为和炎症反应并不完全代表人类原发性巨噬^细胞18的反应谱。因此，为了研究在临床环境中的巨噬细胞ET形成，主要人类单细胞衍生巨噬细胞（HMDMs）被认为是一个更相关的模型，而不是单细胞或鼠狼类似细胞的细胞系。

M1极化HMDM的ET释放已经证明，这些细胞暴露于许多不同的炎症刺激，包括骨髓过氧化物酶衍生的氧化氯酸（HOCl），PMA，TNF®和IL-8⁶。此处描述的是一种将 HmDM 与 M1 表型极化的协议，并在暴露于这些炎症刺激时可视化后续 MET 释放。PMA被用作MET释放的刺激，以方便与以前使用中性粒细胞的研究进行比较。重要的是，HOCl、IL-8和TNF®也用于刺激MET释放，这被认为是体内炎症环境的更好模型。ET释放可视化的微观方法涉及使用SYTOX绿色染色活细胞培养物中的细胞外DNA，这是一种不透水的荧光绿色核酸染色，已成功应用于以前的中性粒细胞研究。此方法允许对 ET 释放进行快速和定性的评估，但它不适合作为 ET 释放范围的量化的独立方法。如果需要量化以比较不同治疗条件或干预措施产生的 ET 释放程度，则应使用替代方法。

Protocol

HMDM与血库提供的人体布漆制剂分离，并经悉尼当地卫生区道德认证。 1. HMDM文化 利用市售制剂分离淋巴细胞，从健康人类捐献者外周血中制备的单核细胞，然后逆流离心性电镀19， 20. 确认单核细胞的存在，通过细胞旋转和染色与修饰的吉姆萨染色单细胞表征19。 在无菌条件下，使用不含血?…

Representative Results

显示HMDM在细胞分化刺激中形态变化的图像如图1所示。M1 与暴露于 IFN® 和 LPS 的 HMDM 实验中产生的 M1 极化巨噬细胞显示了一个长而轴状的细胞形状，如图1（中间面板）中的黑色箭头所示。相比之下，M2极化巨噬细胞在暴露于IL-4444小时后的形态通常是圆形和扁平的，如图1（最右侧面板）中的黑色箭头所示。 分…

Discussion

使用M1分化HMDM生成和可视化MET形成是一种新的体外模型，可能有助于研究这些巨噬菌体结构的潜在病理作用，特别是在慢性炎症下条件。它为刺激原发性人类巨噬细胞释放MET提供了强有力的方案，也可用于与人类单核细胞或鼠群细胞系相关的研究。HMDM刺激MET形成的该协议的成功实施取决于仔细的细胞培养和处理，以保持良好的细胞活力。这将提高所观察到的 MET 的范围和质量。为了提供更好的细?…

Materials

120Q broad spectrum fluorescent light source	EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada		x-cite series
Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells)	Sigma-Aldrich	CLS3336	For cell culture
Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa)	Polysciences Inc.	24606	Characterisation of monocytes
Hanks balanced salt solution (HBSS)	Thermo-Fisher	14025050	For washing steps and HOCl treatment
Hypochlorous acid (HOCl)	Sigma-Aldrich	320331	For MET stimulation
Interferon gamma	Thermo-Fisher	PMC4031	For M1 priming
Interleukin 4	Integrated Sciences	rhil-4	For M2 priming
Interleukin 8	Miltenyl Biotec	130-093-943	For MET stimulation
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	59202C	Added to culture media
Lipopolysaccharide	Integrated Sciences	tlrl-eblps	For M1 priming
Lymphoprep	Axis-Shield PoC AS	1114544	For isolation of monocytes
Olympus IX71 inverted microscope	Olympus, Tokyo, Japan
Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139	For MET stimulation
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D5652	For washing steps
RPMI-1640 media	Sigma-Aldrich	R8758	For cell culture
SYTOX green	Life Technologies	S7020	For MET visulaization
TH4-200 brightfield light source	Olympus, Tokyo, Japan		x-cite series
Tumor necrosis factor alpha	Lonza	300-01A-50	For MET stimulation